PKM抑制劑staurosporine對小鼠腔前卵泡體外發(fā)育影響的研究.pdf

1、哺乳動物卵泡發(fā)育是一個復雜的過程，主要包括卵母細胞的生長和減數(shù)分裂、顆粒細胞增殖、分化，涉及卵母細胞和顆粒細胞間的協(xié)同發(fā)育和調(diào)控等。蛋白激酶C(PKC)超家族包括多種成員，主要分為三類，經(jīng)典型PKC、新型PKC和非典型PKC。PKC超家族成員在多種細胞類型的增殖和分化等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。PKC信號通路在哺乳動物卵母細胞減數(shù)分裂恢復過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，卵丘細胞中PKC的活化可以促進卵母細胞恢復減數(shù)分裂，而卵母細胞中的PK

2、C則抑制卵母細胞成熟，但是PKC在卵泡發(fā)育過程中的作用尚不明了。本課題利用小鼠腔前卵泡體外培養(yǎng)模型和PKC廣譜抑制劑staurosporine(星形孢菌素)，研究在腔前卵泡體外培養(yǎng)過程中的不同階段抑制PKC后其對卵泡發(fā)育、顆粒細胞增殖和細胞凋亡的影響，并通過檢測抑制PKC后對卵泡顆粒細胞縫隙連接蛋白connexin(Cx)43的定位和表達、Smad家族成員Smad4的表達等，嘗試揭示PKC參與卵泡發(fā)育和顆粒細胞功能的調(diào)控機制。主要研究結

3、果如下:
　　 1.抑制PKC嚴重影響小鼠腔前卵泡的體外發(fā)育進程。從出生后12天雌性昆明小鼠卵巢內(nèi)剝離出腔前卵泡進行體外培養(yǎng)，同時向培養(yǎng)液中添加1μM PKC抑制劑staurosporine，48h后在顯微鏡下觀察腔前卵泡體外發(fā)育過程中的形態(tài)變化。添加了staurosporine培養(yǎng)的腔前卵泡形態(tài)與對照組相比顆粒細胞變圓、卵泡邊緣變得模糊，卵母細胞在staurosporine處理48小時發(fā)生萎縮死亡。同時為了研究PKC在成熟卵泡

4、體外排卵過程中的作用，在體外將腔前卵泡培養(yǎng)至有腔成熟階段后，給卵泡加入含激素的排卵誘導成熟液，16h后觀察卵母細胞排出情況以及卵母細胞成熟情況（是否GVBD、是否排出第一極體）。添加了staurosporine的實驗組中，成熟卵泡的排卵活動完全受到了抑制，即使有排出卵母細胞，也是已經(jīng)死亡的卵母細胞。
　　 2.抑制PKC對顆粒細胞增殖具有顯著影響。取小鼠顆粒細胞進行體外培養(yǎng)，約72小時后細胞生長到所需密度，給細胞更換含不同濃度(

5、0.2μM、0.5μM、1μM)staurosporine的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)14小時后，顯微鏡下觀察形態(tài)變化且拍照，并處理細胞進行流式細胞儀檢測細胞凋亡率。顆粒細胞形態(tài)隨著抑制劑濃度的增加發(fā)生變化，細胞膜呈絲狀向四周擴展，同時早期凋亡率也顯著上升，對照組為5.31％，0.2μM組上升到16.67％，0.5μM組則為26.55％，1μM組則升高到32.15％，SPSS統(tǒng)計分析表明隨著staurosporine濃度的增加凋亡率上升，并表現(xiàn)出顯

6、著差異。
　　 3.抑制PKC后影響腔前卵泡體外發(fā)育過程中縫隙連接蛋白connexin43的定位模式。向體外培養(yǎng)的腔前卵泡添加1μM staurosporine培養(yǎng)48h后，利用免疫熒光細胞化學檢測縫隙連接蛋白connexin43在顆粒細胞中的定位。結果顯示，對照組的腔前卵泡中，Cx43定位在卵泡內(nèi)圍繞在卵母細胞周圍的顆粒細胞之間，當卵泡受到staurosporine的抑制后，Cx43的定位盡管還在顆粒細胞之間，但顯得雜亂無序，

7、且信號微弱。單獨培養(yǎng)的顆粒細胞中抑制PKC后，與對照組培養(yǎng)的顆粒細胞中Cx43的定位模式進行比較，結果發(fā)現(xiàn)Cx43盡管仍然定位在細胞膜上，但不能形成完整的細胞縫隙連接通道。同時磷酸化的Cx43在顆粒細胞中的表達也有所降低。這些結果暗示抑制PKC后破壞了細胞縫隙連接通道，阻斷了顆粒細胞之間的通訊及物質運輸與交換，結果導致顆粒細胞功能和卵泡發(fā)育受到顯著抑制。
　　 4.抑制PKC后影響腔前卵泡體外發(fā)育中Smad家族成員Smad4蛋白

8、的表達水平。在哺乳動物卵泡早期發(fā)育中，卵母細胞合成和分泌的TGFβ家族成員GDF9和BMP15與周圍顆粒細胞表達的Smad復合物結合，對顆粒細胞的增殖和分化具有重要調(diào)節(jié)作用。利用Western blot發(fā)現(xiàn)在PKC受到抑制的腔前卵泡中Smad4蛋白表達量上升，這些結果暗示PKC抑制后可能阻斷了卵母細胞和顆粒細胞之間的交流和通訊，促使顆粒細胞增殖或分化阻滯，最終顆粒細胞為了自身的增殖和分化，故而合成更多的Smad4以嘗試接受來自卵母細胞的