不同組蛋白去乙?；敢种苿ωi體細胞克隆胚胎體外發(fā)育能力的影響.pdf

1、目的：自第一只克隆羊誕生以后，牛，羊，貓，鼠，驢，馬，狗等動物也都被相繼克隆出來，然而體細胞核移植技術(shù)生產(chǎn)的克隆動物其成功率低,這與表觀遺傳異常有一定關(guān)聯(lián)，這其中就包括組蛋白乙?；漠惓！Ｍㄟ^組蛋白去乙?；种苿?，可以改變表觀遺傳狀態(tài)，從而進一步提高體細胞克隆胚胎的發(fā)育潛能。LBH589，CUDC-101，PXD101，已經(jīng)有研究證明這三種去乙?；种苿┛梢蕴岣呓M蛋白乙?；?，但是在體細胞克隆胚胎方面至今還未有人使用。本研究是首次使用

2、這三種去乙酰化抑制劑探究其對豬SCNT胚胎的影響。
　　方法：利用不同濃度的組蛋白去乙酰化抑制劑(LBH589，CUDC-101 and PXD101)處理豬體細胞克隆胚胎24小時，尋找最適合濃度，隨后用最適濃度處理不同時間。確定好最佳時間和最佳濃度后，進行免疫熒光染色觀察胚胎乙?；健Ｔ诿糠N藥品處理之后，將胚胎通過胚胎移植移入代孕母豬體內(nèi)，觀察其妊娠情況。
　　結(jié)果：（1）在體外發(fā)育的胚胎給予不同濃度的LBH589處理，

3、觀察各濃度對于胚胎發(fā)育能力的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)50nM的LBH589處理24h的胚胎與對照組以及5,500nM處理組相比，其囊胚率明顯提高(32.4％ vs.11.8%,12.1%，and10.0%，respectively，P<0.05)。用50nM的LBH589處理重構(gòu)胚不同的時間，并在處理后使用6-DMAP激活胚胎。結(jié)果可知，經(jīng)24h處理的胚胎，囊胚率高于其他組別。對用LBH589處理6h的胚胎使用H4K12抗體進行免疫熒光染色。

4、結(jié)果顯示，經(jīng)LBH589處理后的胚胎，其熒光強度強于其他組別。對LBH589處理的胚胎以及未經(jīng)處理胚胎進行胚胎移植，移植到代孕母豬體內(nèi)。結(jié)果顯示，經(jīng)藥物處理以及未經(jīng)藥物處理的胚胎移植成功率分別為100%和66.7%。綜上所述，LBH589可以通過改變表觀遺傳狀態(tài)來提高SCNT胚胎的發(fā)育潛力以及重編程的能力，并能增加囊胚的質(zhì)量。（2）發(fā)現(xiàn)對豬SCNT胚胎使用1μM的CUDU-101處理24h，可以明顯提高胚胎的發(fā)育能力(18.5%vs.1

5、0.3%，P<0.05)。為了進一步評價其體內(nèi)發(fā)育力，將使用 CUDU-101處理的胚胎進行胚胎移植到兩頭代孕母豬體內(nèi)，結(jié)果顯示一頭母豬妊娠且懷有6個胎兒。對經(jīng)藥物處理以及未經(jīng)藥物處理的胚胎分別進行了H3K9組蛋白乙?；降难芯俊＝Y(jié)果顯示，在1細胞期，未經(jīng)CUDU-101處理的胚胎其乙?；矫黠@低于經(jīng)CUDU-101處理的胚胎。綜上所述，CUDU-101可以顯著提高豬SCNT胚胎體內(nèi)及體外核重編程的發(fā)育能力。（3）經(jīng)0.5μM的PX

6、D101處理的胚胎其囊胚率較對照組相比有明顯提高(23.3%vs.11.5%，P<0.05)。隨后，使用0.5μM的PXD101分別對胚胎處理不同的時間。結(jié)果顯示，處理24h的組別其囊胚率明顯高于對照組(25.7%vs.10.6%，P<0.05)。將使用PXD101處理的胚胎進行胚胎移植到兩頭代孕母豬體內(nèi)，結(jié)果顯示一頭妊娠且懷有4個胎兒。在探究PXD101對胚胎乙酰化水平影響的實驗中，實驗結(jié)果顯示，經(jīng)PXD101處理的組別，在1細胞期和