建立NHEJ修復(fù)定量體系并探討組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA對DSBs的影響.pdf

1、[目的]
　　1.建立含Ⅰ-SCEⅠ酶切位點的總的非同源末端連接(Total Non-homologousend joining，Total-NHEJ)和非經(jīng)典末端連接(alternative end joining，A-EJ)修復(fù)底物的細胞株。
　　2.初步探討組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA對DNA雙鏈斷裂(DNA doublestrand breaks，DSBs)修復(fù)路徑相關(guān)基因mRNA的影響。
　　3.流式細胞儀

2、定量檢測SAHA對非同源末端連接NHEJ(Non-homologousend joining)和單鏈退火修復(fù)SSA(single strand annealing)修復(fù)路徑的影響。
　　[方法]
　　通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染含Ⅰ-SCEⅠ修復(fù)底物的線性化質(zhì)粒，嘌呤霉素篩選，構(gòu)建Total-NHEJ和A-EJ修復(fù)系統(tǒng)的穩(wěn)定細胞株;設(shè)置特定的流式細胞儀參數(shù)，運用流式細胞術(shù)和PCR技術(shù)對所構(gòu)建的細胞株進行分析與鑒定;Real-time PC

3、R檢測組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA作用之后細胞DSB修復(fù)相關(guān)基因C末端結(jié)合蛋白作用因子[CtBP(C-terminal binding protein)-Interacting Protein，CtIP]、減數(shù)分裂重組11(Meiotic Recombination11，Mre11)、復(fù)制蛋白A(Replication ProteinA，RPA)、PARP1(Poly(ADP-ribose) polymerase1)、Rad51、Ra

4、d52、KU80的mRNA表達情況;流式細胞儀定量檢測SAHA對NHEJ和SSA路徑修復(fù)效率的影響。
　　[結(jié)果]
　　1.在所篩選的細胞中各得到2株整合有Total-NHEJ底物細胞株和A-EJ底物細胞株。
　　2.依托泊苷VP-16促進Total-NHEJ和A-EJ修復(fù)效率增加，并呈濃度依賴性關(guān)系。
　　3.組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA可下調(diào)KU80+/+倉鼠卵巢細胞CHO細胞中的DSB修復(fù)相關(guān)蛋白kU80

5、、Mre11、Rad51、Rad52的mRNA水平表達，但上調(diào)PARP1的mRNA水平表達。
　　4.組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA下調(diào)KU80-/-XRS5細胞中DSB修復(fù)相關(guān)基因CtIP、PARP1、Rad52的mRNA水平表達。
　　5.組蛋白去乙酰化酶抑制劑SAHA顯著下調(diào)MCF-7細胞中修復(fù)基因Mre11、PARP1的表達，而SAHA對人正常細胞HEK293修復(fù)基因無影響。
　　6.流式細胞儀檢測SAHA對K

6、U+/+的CHO中Total-NHEJ修復(fù)作用，顯示其效率受抑制并呈劑量依賴關(guān)系，2.0μM、4.0μM濃度Total-NHEJ修復(fù)效率分別下降了49.86％和65.66％。
　　7.流式細胞儀檢測SAHA對KU-/-的倉鼠卵巢細胞XRS5中A-EJ修復(fù)作用，顯示其效率抑制呈劑量依賴關(guān)系，2.0μM、4.0μM濃度A-EJ修復(fù)效率分別下降了64.51％和94.01％。
　　[結(jié)論]
　　1.構(gòu)建了含Ⅰ-SCEⅠ酶切位點