組蛋白去乙?；敢种苿㎡xamflatin對豬體細胞克隆胚胎體外發(fā)育率的影響.pdf

1、體細胞核移植技術(shù)(SCNT)是指將一個分化的體細胞與去核的卵母細胞融合形成一個重構(gòu)胚胎，并發(fā)育產(chǎn)生與供體細胞遺傳背景一致的克隆后代的技術(shù)。自1996年多利羊誕生以來，研究人員利用體細胞核移植技術(shù)已經(jīng)成功克隆出很多哺乳動物后代，如小鼠、狗、貓、牛、豬等。但盡管該技術(shù)已經(jīng)發(fā)展了近20年，但體細胞克隆效率還是很低（哺乳動物大約1％-5％），而且體細胞克隆后代常常出現(xiàn)一些異常的表型:表現(xiàn)為胚胎著床率低、胎兒流產(chǎn)率高，克隆動物體型過大并伴隨各種器

2、官發(fā)育缺陷的癥狀，也被稱為大型胎兒綜合癥。但表型異常的克隆動物可以正常繁殖且后代表型都正常，說明克隆動物的異常表型是由異常的表觀遺傳修飾造成的而不是由于遺傳物質(zhì)的改變引起的。目前研究普遍認為體細胞核移植效率低的原因是卵母細胞對體細胞核不完全或異常的重編程導致的。
　　體細胞核移植技術(shù)是一項很有應用前景的技術(shù)，不僅可以幫助我們了解體細胞重編程的機理，同時可以用于人的器官移植等醫(yī)學研究。SCNT技術(shù)與基因編輯技術(shù)相結(jié)合，可以生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因

3、豬，如抗病型豬，優(yōu)良肉品質(zhì)性狀豬，環(huán)境友好型豬等。鑒于體細胞核移植重要的應用價值以及其較低的克隆效率，本研究圍繞如何能提高豬的克隆效率這一基本問題展開，在提高其體外克隆效率的同時，在重編程的分子機理進行了進一步的探索，其主要結(jié)果如下所述:
　　1.通過預實驗我們發(fā)現(xiàn)，在豬合子培養(yǎng)基（PZM-3）中添用一定劑量的組蛋白去乙?；敢种苿㎡xamflatin，能顯著提高豬體外克隆胚胎囊胚形成率。然后我們優(yōu)化了Oxamflatin的處理條

4、件（不同的處理濃度和持續(xù)時間），發(fā)現(xiàn)用1μM的組蛋白去乙?；敢种苿㎡xamflatin處理激活后的重構(gòu)胚胎15h，顯著提高了其體外囊胚發(fā)育率（未處理組vs.處理組;10.3％ vs.25.5％;p＜0.05）。
　　2.用1μM的Oxamflatin處理豬克隆胚胎15h顯著降低了重構(gòu)胚胎原核時期總的去乙?；傅幕钚?，提高了克隆胚胎原核期，2細胞和4細胞時期，總的組蛋白H3K9和H4K5的乙?；?。我們檢測了四種類型的豬的組蛋白

5、去乙?；福ò℉DAC1-11，和Sirt1，2）在MⅡ期卵母細胞和豬胎兒成纖維細胞中的mRNA表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HDAC1、2和3在MⅡ期卵母細胞的相對表達量比胎兒成纖維細胞高，同時也相對比其他類型的組蛋白去乙?；副磉_要高。Oxamflatin處理顯著降低了重構(gòu)胚胎原核時期HDAC1的表達，部分上解釋了Oxamflatin處理介導的高乙?；慕M蛋白H3K9和H4K5水平。
　　3.我們同時檢測了一個非組蛋白α-tubuli

6、n蛋白的乙?；?，發(fā)現(xiàn)用1μM的Oxamflatin處理15h顯著提高了豬重構(gòu)胚胎的中間體和紡錘體在胚胎激活后的前兩個有絲分裂細胞周期過程中乙?；?tubulin的水平，這可能是通過抑制HDAC6的表達所介導的。
　　4.通過熒光定量PCR我們發(fā)現(xiàn)DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)在豬MⅡ期卵母細胞中占主導，它的表達量相對于其同源基因DNMT2，DNMT3a和3b的表達量要高出50多倍。通過免疫熒光染色我們檢測了豬克隆胚胎在2

7、細胞和4細胞時期總的5-mC和5-hmC水平，結(jié)果表明，豬SCNT胚胎從2細胞到4細胞時期，總的5-mC和5-hmC水平逐漸降低。用1μM的Oxamflatin處理豬重構(gòu)胚胎15h顯著地降低了豬克隆胚胎2細胞時期總的DNA甲基化水平，同時降低了DNMT1在2細胞時期的表達。
　　5.用1μM的Oxamflatin處理豬重構(gòu)胚胎15h顯著提高了多潛能基因POU5F1在豬克隆胚胎囊胚階段的表達，這可能是通過降低POU5F1啟動子區(qū)域D

8、NA甲基化水平引起的。但是，Oxamflatin處理并沒有改變豬衛(wèi)星DNA序列的甲基化水平。
　　6.低劑量的Oxamflatin處理沒有抑制豬胎兒成纖維細胞的生長狀態(tài)，Oxamflatin處理同樣導致了豬胎兒成纖維細胞較高的組蛋白H3K9、H4K5和非組蛋白α-tubulin的乙?；?，同時Oxamflatin處理在一定程度上降低了豬胎兒成纖維細胞總的DNA甲基化水平。但是用Oxamflatin預處理的豬胎兒成纖維細胞作為核供