新生大鼠卵母細胞凋亡信號通路調(diào)控的實驗研究.pdf

1、目的：研究FOXO3a（forkhead box group O）轉(zhuǎn)錄因子是否參與調(diào)控哺乳動物卵巢中裸露卵母細胞和原始卵泡內(nèi)卵母細胞的凋亡及其調(diào)控通路。
　　 方法：（1）體外分離培養(yǎng)新生兩天大鼠卵母細胞巢和原始卵泡內(nèi)的卵母細胞。（2）實驗分組和藥物處理細胞方法：干細胞因子（Stem cell factor， SCF）和磷脂酰肌醇- 3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）抑制劑LY 294002作

2、用細胞的終濃度分別為150ng/L和25μM。實驗分為三組：未經(jīng)處理的細胞作為對照組（SCF-），SCF處理細胞組（SCF+）和SCF聯(lián)合LY 294002處理細胞組（SCF+LY 294002）。為研究SCF對AKT、FOXO3a磷酸化的影響及其調(diào)控通路，SCF處理細胞組：SCF作用于細胞5 min；SCF聯(lián)合LY 294002處理細胞組：LY 294002作用于細胞1 h后再加入SCF作用5 min。為研究SCF對卵母細胞凋亡和Bi

3、m、Bcl-2、Bax、Bad、MnSOD和p27kip1表達的影響及其調(diào)控通路，SCF處理細胞組：SCF作用于細胞24 h；SCF聯(lián)合LY 294002處理細胞組：SCF與LY 294002同時加入細胞培養(yǎng)基，共同作用24 h。（3）凋亡染色（TUNEL）觀察卵母細胞凋亡狀況。陽性結(jié)果判斷: 被染成棕黃色的為陽性細胞。凋亡率的計算方法:在400倍視野下，每張玻片上選取至少三個視野共100個細胞計數(shù)陽性卵母細胞占所有卵母細胞的百分比。（

4、4）RT-PCR、Western blot檢測觀察FOXO3a及其下游靶分子與卵母細胞凋亡的關系。（5）免疫細胞化學檢測：細胞分別與一抗FOXO3a、BIM、BAD、BAX、BCL-2、MnSOD或p27KIP1 (抗體1:25 或1:100稀釋) 及對應的二抗孵育；3,3'二氨基聯(lián)苯胺(3,3'-diaminobenzidine，DAB) 顯色。細胞陽性率的計算方法: 在400倍視野下，每張玻片上選取至少三個視野共100個細胞計數(shù)，得

5、出陽性卵母細胞占所有卵母細胞的百分比。（6）采用SPSS 13. 0 軟件包進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(?x±s) 表示,組間比較均作單向方差分析, P ＜0.05有統(tǒng)計學差異，所有實驗至少重復三次。
　　 結(jié)果：（1）SCF抑制卵母細胞凋亡；而LY 294002可完全阻斷上述效果。（2）SCF不影響卵母細胞AKT、FOXO3a總蛋白表達水平，但可使其磷酸化水平增加；磷酸化的AKT活性增強，而磷酸化的FOXO3a 活性下

6、降。（3）SCF可使Bim、Bax、Bad和p27kip1表達下調(diào)，此作用同樣可被LY 294002逆轉(zhuǎn)。（4）SCF可使MnSOD表達上調(diào)，LY 294002可阻斷該效果。（5）SCF不影響B(tài)cl-2的表達。
　　 結(jié)論：（1）FOXO3a通過SCF-PI3K/AKT信號通路參與對新生大鼠卵母細凋亡和原始卵泡形成的調(diào)控。（2）Bim、Bax、Bad、MnSOD和p27kip1可能作為FOXO3a的下游靶分子參與以上調(diào)控過程。<