丙酮酸調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞排卵后老化的研究.pdf

1、卵母細(xì)胞排卵后老化顯著影響其胚胎發(fā)育。排卵后老化的卵母細(xì)胞受精后出生的小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)敏感和情緒的異常。與輸卵管內(nèi)滯留一樣,體外培養(yǎng)成熟卵母細(xì)胞也會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞老化。然而,人類和一些動(dòng)物通常可以在發(fā)情周期的任何一天從事性行為,這可能導(dǎo)致排卵后老化的卵母細(xì)胞受精。另外,許多研究和臨床應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)都涉及成熟卵母細(xì)胞在顯微操作和授精前的體外培養(yǎng)。因此,研究卵母細(xì)胞老化的機(jī)制并且調(diào)控卵母細(xì)胞老化無論對(duì)人類還是非人類動(dòng)物的健康生殖都是非常重要的。

2、 老化卵母細(xì)胞最明顯的特征包括對(duì)激活刺激敏感性的增加、MPF活性降低、后期II的啟動(dòng)、皮質(zhì)顆粒部分胞吐、線粒體聚集、微管組裝變化,并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡的征兆,例如胞質(zhì)和DNA斷裂以及Bcl-2蛋白水平的降低。另外,老化的小鼠卵母細(xì)胞中組蛋白的某些賴氨酸位點(diǎn)乙?；皆黾?而且由于老化過程中的氧化應(yīng)激造成ROS的累積,并改變卵母細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài),造成卵母細(xì)胞內(nèi)總的GSH量減少以及GSH/GSSG比例的降低。 我們之前的研究證

3、明卵丘細(xì)胞能夠促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞老化。然而,卵丘細(xì)胞促進(jìn)卵母細(xì)胞老化的確切機(jī)制還不清楚。據(jù)報(bào)道成熟卵母細(xì)胞能夠代謝丙酮酸,并且在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)比裸卵(DOs)消耗更多的丙酮酸。我們猜測(cè)卵母細(xì)胞在不含丙酮酸的條件下老化的更快,并且卵丘細(xì)胞可能通過消耗不含葡萄糖的CZB中的丙酮酸從而促進(jìn)卵母細(xì)胞老化。為了驗(yàn)證這個(gè)猜測(cè),我們將新排卵的小鼠卵母細(xì)胞培養(yǎng)在添加不同濃度丙酮酸的CZB中,然后進(jìn)行激活處理或通過放射自

4、顯影的方法分析MPF活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)丙酮酸以劑量依賴性的方式降低COCs和DOs的激活率,而升高其MPF活性,卵丘細(xì)胞存在的情況下需要更多的丙酮酸。新鮮排卵的DOs培養(yǎng)在不另外添加丙酮酸的COCs條件化的CZB中,其激活率顯著升高,MPF活性顯著降低,然而,當(dāng)在條件化培養(yǎng)基中添加10 mM丙酮酸后,DOs的激活率和MPF活性都與新鮮卵母細(xì)胞無差別。我們通過毛細(xì)管電泳試驗(yàn)證明,COCs和卵丘細(xì)胞單層制備的CZB條件化培養(yǎng)基中丙酮酸的含量顯著

5、低于新鮮制備的CZB、單獨(dú)培養(yǎng)的CZB以及DOs條件化的CZB中丙酮酸的含量。這些結(jié)果有力地驗(yàn)證了我們的猜測(cè)：在不含葡萄糖的培養(yǎng)液中卵丘細(xì)胞通過消耗丙酮酸從而促進(jìn)卵母細(xì)胞老化。 為了檢測(cè)丙酮酸對(duì)卵母細(xì)胞其他老化指標(biāo)的影響,我們通過免瘴熒光顯微鏡檢查法觀察了皮質(zhì)顆粒的提前胞吐、線粒體分布、微管組裝、抗凋亡蛋白Bcl-2水平、組蛋白乙?；?通過Hoechst33342染色觀察了后期II的啟動(dòng),通過體外受精及其隨后的胚胎發(fā)育能力檢

6、測(cè)了丙酮酸對(duì)老化卵母細(xì)胞發(fā)育潛力的影響。結(jié)果證明,丙酮酸能夠顯著抑制老化卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒的提前胞吐、線粒體聚集、微管組裝的變化；并且顯著抑制了Bcl-2、組蛋白乙酰化水平以及胞質(zhì)碎裂比例的升高,說明丙酮酸能夠顯著抑制老化小鼠卵母細(xì)胞的凋亡。另外,我們的數(shù)據(jù)還證明老化過程中添加丙酮酸能夠顯著抑制老化對(duì)卵母細(xì)胞受精及其發(fā)育能力所造成的損傷。這些數(shù)據(jù)表明,丙酮酸能夠顯著抑制COCs和DOs的老化。 為了驗(yàn)證丙酮酸是否通過其抗氧化作用從

7、而抑制卵母細(xì)胞老化,我們通過2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate(DCHFDA)染色的方法檢測(cè)了老化卵母細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,并通過DTNB-GSSG還原酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了老化卵母細(xì)胞內(nèi)總GSH、還原型GSH水平以及GSH/GSSG比例。結(jié)果表明,丙酮酸能夠顯著抑制老化卵母細(xì)胞中ROS水平的增加,并且能夠顯著抑制總GSH和GSH水平以及GSH/GSSG比例的降低。這些數(shù)據(jù)表明,丙酮酸可能通過其抗氧

8、化作用維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原水平,顯著削弱卵母細(xì)胞老化過程中的氧化應(yīng)激對(duì)其造成的損傷。 因此,我們得出結(jié)論：丙酮酸能夠抑制小鼠COCs和DOs的老化,卵丘細(xì)胞通過消耗培養(yǎng)液中的丙酮酸從而促進(jìn)卵母細(xì)胞老化。而且,從我們現(xiàn)在的數(shù)據(jù)可以看出,很顯然在卵母細(xì)胞老化過程中添加丙酮酸能夠顯著提高排卵后老化卵母細(xì)胞的質(zhì)量,并降低其凋亡指標(biāo)。丙酮酸很可能通過其抗氧化作用從而維持卵母細(xì)胞GSH/GSSG比例,并阻止總GSH含量的降低以及胞質(zhì)內(nèi)ROS