葡萄糖抑制小鼠卵母細胞老化的機理及小鼠卵母細胞的體外保存.pdf

1、第一部分：哺乳動物卵母細胞排卵后停留于輸卵管內(nèi)，若不及時受精就會發(fā)生老化。老化將影響卵母細胞受精后的胚胎發(fā)育。老化卵母細胞受精后出生的小鼠出現(xiàn)明顯的神經(jīng)敏感和情緒異常以及生殖能力下降和壽命縮短等現(xiàn)象。與在輸卵管內(nèi)滯留相似，卵母細胞在體外培養(yǎng)也發(fā)生老化。然而，許多動物(包括人類)可能在發(fā)情周期中的任何一段時間進行交配，很容易導致老化的卵母細胞發(fā)生受精。另外，在許多臨床治療及胚胎工程研究(如體細胞核移植及人工輔助生殖)中，卵母細胞往往要先培

2、養(yǎng)一段時間，再進行授精或者顯微操作，也有可能導致卵母細胞的老化。例如，要保證體細胞克隆的成功，受核胞質(zhì)的細胞周期必須嚴格控制；如果用老化卵母細胞作為受核胞質(zhì)，細胞融合率和核移植胚胎的發(fā)育率將會顯著降低。因此，研究卵母細胞老化的機制及調(diào)控，對于哺乳動物的健康生殖及胚胎工程技術發(fā)展都至關重要。
　　 有研究表明，體外培養(yǎng)液中能量物質(zhì)組成的輕微變化對卵母細胞減數(shù)分裂成熟產(chǎn)生巨大影響。例如，去除培養(yǎng)液中的葡萄糖，卵泡刺激素(FSH)不能

3、誘導卵母細胞減數(shù)分裂恢復。在無葡萄糖條件下，毫摩爾級的丙酮酸能夠克服由次黃嘌呤或雙丁酰環(huán)腺苷酸(dbcAMP)引起的減數(shù)分裂阻滯。另外，F(xiàn)SH能夠激活卵丘-卵母細胞復合體中的己糖激酶，因而通過糖酵解途徑促進葡萄糖代謝。因此，可以推測，葡萄糖很可能是通過酵解產(chǎn)生丙酮酸，后者參與三羧酸循環(huán)提供卵母細胞成熟所需的能量。然而，有研究表明，葡萄糖誘導減數(shù)分裂的作用并不依賴糖酵解產(chǎn)生丙酮酸。例如，利用碘乙酸抑制葡萄糖酵解途徑不影響黃體生成素(LH)

4、誘導的減數(shù)分裂恢復。2-脫氧葡萄糖能夠抑制FSH誘導的減數(shù)分裂恢復，但不抑制糖酵解途徑。另外，向培養(yǎng)基中單獨添加丙酮酸不提高卵母細胞中的ATP水平，丙酮酸或促性腺激素處理未增加COCs的耗氧量。由于發(fā)現(xiàn)嘌呤核苷酸生成途徑參與促性腺激素誘導的減數(shù)分裂過程，葡萄糖的作用很可能通過磷酸戊糖途徑來實現(xiàn)的，因為PPP途徑能夠提供5.磷酸核糖，用于嘌呤核苷酸生成通路的重要底物-磷酸核糖焦磷酸的合成。
　　 最近我們研究表明丙酮酸抑制小鼠卵母

5、細胞老化，然而，卵丘細胞特別是丙酮酸調(diào)控卵母細胞的機理仍然不清楚。此外由于氧化應激能夠引起細胞內(nèi)氧化還原潛力失衡，導致早期胚胎凋亡并且排卵后卵母細胞老化，因此了解代謝如何調(diào)控卵母細胞氧化還原潛能具有非常重要的作用。此實驗，我們用小鼠排卵后老化卵母細胞為模型，研究表明：
　　 1)卵母細胞本身能夠利用丙酮酸或乳酸抑制老化，但只有存在卵丘細胞的情況下才能利用葡萄糖。卵丘細胞通過產(chǎn)生丙酮酸或乳酸抑制卵母細胞老化。
　　 2)新

6、鮮COCs培養(yǎng)在含葡萄糖和不同濃度的DHEA(PPP抑制劑)和/或iodoacetate(糖酵解途徑的抑制劑)CZB培養(yǎng)液中，結(jié)果表明隨著藥物濃度的增加，激活率增加，當抑制糖酵解時60％卵母細胞發(fā)生老化，當抑制PPP時，幾乎所有的卵母細胞都老化。通過測細胞內(nèi)總谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽/氧化型比值，表明PPP主要通過維持了谷胱甘肽的還原狀態(tài)抑制卵母細胞老化。
　　 3)乳酸通過乳酸脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)楸嵋种坡涯讣毎匣?，丙酮酸不依賴與

7、乳酸脫氫酶產(chǎn)生的乳酸；乳酸通過產(chǎn)生NADH而后進入呼吸鏈產(chǎn)生ATP抑制卵母細胞老化，而丙酮酸不完全依賴與呼吸鏈抑制卵母細胞老化。
　　 4)當用4-CIN抑制了單糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(能夠?qū)翁寝D(zhuǎn)運入細胞或線粒體)，存在丙酮酸或乳酸，卵母細胞激活率都達到最高水平。表明丙酮酸或乳酸抑制卵母細胞老化涉及到了線粒體電子傳遞鏈并且在老化卵母細胞胞質(zhì)或線粒體上MCT是有活性的。
　　 5)卵丘細胞中PPP或糖酵解通過產(chǎn)生丙酮酸抑制卵母細胞老

8、化。丙酮酸通過其代謝進入線粒體抑制卵母細胞老化。
　　 6)缺乏能量供給，巰基物質(zhì)的添加對卵母細胞老化和谷胱甘肽合成沒有影響。存在能量物質(zhì)時卵母細胞能合成谷胱甘肽，0.27mM丙酮酸通過調(diào)控細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)和能量供給抑制卵母細胞老化，0.15mM丙酮酸時只能調(diào)控能量供給。
　　 第二部分：抑制卵母細胞老化對健康生殖和輔助生殖技術非常重要，低溫降低細胞代謝并且降低ROS產(chǎn)生。研究表明低溫抑制缺血后的凋亡，在大鼠中對彌散

9、惱損傷后的細胞凋亡起抑制作用。有報道表明將牛卵巢保存于10,15或25℃對體外受精和體細胞核移植后的卵母細胞發(fā)育能力有保護作用，此外在體細胞中研究表明降低培養(yǎng)溫度能夠增加細胞活性，降低凋亡。我們研究表明丙酮酸通過維持能量供給和氧化還原潛力抑制小鼠卵母細胞體外老化，并且添加10mM丙酮酸，卵母細胞受精或孤雌激活后囊胚發(fā)育潛力維持6小時。我們假設通過降低培養(yǎng)溫度并且給予充足的丙酮酸，卵母細胞老化可能會維持更長時間，研究結(jié)果表明：
　　

10、 1)隨著培養(yǎng)時間的延長，卵母細胞酒精激活率增加，增加丙酮酸濃度能夠明顯降低卵母細胞酒精激活率的增加；
　　 2)保存溫度由37℃降到15℃，卵母細胞酒精激活率下降，但是在相同條件下5℃比15℃激活率要高；
　　 3)氯化鍶處理后各保存組激活率沒有差異，25℃保存24小時，15℃保存36小時和5℃保存24小時，卵母細胞囊胚發(fā)育率高達60％；
　　 4)除了5℃保持48小時受精率下降，其他處理組受精率沒有差異。2

11、5℃保存24小時，15℃保存36小時和5℃保存24小時，卵母細胞受精后的囊胚率高達80％；
　　 5)將實驗組15℃保存36小時卵母細胞受精后的二細胞或囊胚，和對照組新鮮卵受精后的二細胞或囊胚分別移植到受體小鼠輸卵管傘和子宮內(nèi)，妊娠率、產(chǎn)仔數(shù)、移植胚胎中發(fā)育到期的胚胎數(shù)和胎兒出生重實驗組和對照組沒有差異。
　　 6)卵母細胞在15℃中保存96小時和5℃中保存48小時發(fā)育能力受損，并且GSH含量、GSH/GSSG比例、BC