斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞的體外成熟及卵母細(xì)胞的玻璃化凍存.pdf

1、本文以斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，通過(guò)亮甲酚藍(lán)染色法判斷卵母細(xì)胞成熟度和采用不同濃度、不同處理時(shí)間17α-羥基孕酮處理斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞，對(duì)斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞體外促成熟進(jìn)行研究；通過(guò)采用不同配方玻璃化凍存液凍存，并結(jié)合凍存后細(xì)胞存活率的檢測(cè)，對(duì)斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞玻璃化凍存條件進(jìn)行篩選；通過(guò)檢測(cè)凍存后細(xì)胞中三種線粒體ATP酶(Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Na+K+-ATP酶)的活性和谷胱甘肽含量變化，對(duì)玻璃化冷凍保存對(duì)斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞的損傷作用等進(jìn)行

2、研究。主要研究結(jié)果如下：
　?。?）比較通過(guò)亮甲酚藍(lán)染色法和卵母細(xì)胞直徑大小、細(xì)胞形態(tài)判斷卵母細(xì)胞成熟度的結(jié)果，判定亮甲酚藍(lán)染色法用于斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞成熟度的評(píng)估可行且更便捷。篩選出亮甲酚藍(lán)染色濃度為20μmol/L、染色時(shí)間為150min的染色效果最佳。
　　（2）實(shí)驗(yàn)以不添加17α-羥基孕酮的培養(yǎng)液為對(duì)照組，以濃度分別為1 nmol/L、10 nmol/L、100 nmol/L和1000 nmol/L的17 a-羥基孕酮培

3、養(yǎng)液為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)6 h、12 h和24 h，以亮甲酚藍(lán)染色法評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞的體外成熟情況。結(jié)果表明：1）17α-羥基孕酮對(duì)斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞的存活率沒(méi)有明顯影響；2）17α-羥基孕酮濃度為1 nmol/L、10 nmol/L處理6 h，卵母細(xì)胞的成熟率分別為50.99％和44.30%，但與對(duì)照組比較差異不顯著，因此推斷低濃度的17α-羥基孕酮（1 nmol/L和10 nmol/L）對(duì)斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞的成熟無(wú)明顯促進(jìn)作用

4、；17α-羥基孕酮濃度為1000 nmol/L處理6 h，卵母細(xì)胞的成熟率分別為33.30%，與對(duì)照組相比成熟率下降明顯，說(shuō)明高濃度的17α-羥基孕酮（1000 nmol/L）對(duì)卵母細(xì)胞的成熟反而不利；17α-羥基孕酮濃度為100 nmol/L、處理12 h后，成熟率為40.72%，顯著高于對(duì)照組（p<0.05），對(duì)卵母細(xì)胞成熟有明顯的促進(jìn)作用。3）17α-羥基孕酮濃度在1-1000 nmol/L區(qū)間處理6小時(shí)，斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞半成熟的比

5、率隨孕酮處理濃度的增加而增加，都高于對(duì)照組，且在100 nmol/L和1000 nmol/L劑量組半成熟的卵母細(xì)胞比率分別達(dá)47.92%和56.48%，與對(duì)照組相比差異顯著（p<0.05），說(shuō)明17α-羥基孕酮對(duì)卵母細(xì)胞在成熟的過(guò)程中有一定的促進(jìn)作用，且孕酮濃度越大效果越明顯。
　?。?）設(shè)置9組（V1~V9）配方不同的玻璃化液對(duì)斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化凍存（-196℃），分別檢測(cè)凍存1d、2d、4d和8d后卵母細(xì)胞的存活率，結(jié)果

6、表明：V4組的存活率最高，且顯著高于其它組，其卵母細(xì)胞存活率在凍存1d、2d、4d和8d后分別為48.89±2.58%、39.35±1.34%、24.18±2.32%和14.56±1.64%，凍存1-2d效果較好，但隨著凍存時(shí)間的增加，卵母細(xì)胞存活率明顯下降；該玻璃化液組分是：1.5mol/L甲醇、6.0mol/L乙二醇、0.25 mol/L蔗糖。
　　（4）對(duì)玻璃化凍存后斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞的線粒體ATP酶的活性和谷胱甘肽含量進(jìn)行了研

7、究。結(jié)果表明：1）各實(shí)驗(yàn)組 Ca2+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Na+K+-ATP酶活性在凍存1d、2d、4d和8d后均顯著下降，其中V4組的各種酶活性相對(duì)較高，經(jīng)檢測(cè)其Ca2+-ATP酶活性在凍存1d、2d、4d和8d后分別為：3.823±0.144U/mgprot、3.492±0.084U/mgprot、2.554±0.097U/mgprot和1.930±0.076U/mgprot；Mg2+-ATP酶活性分別為4.503±0.1

8、44 U/mgprot、4.134±0.182U/mgprot、2.972±0.096U/mgprot和2.113±0.073 U/mgprot；Na+K+-ATP酶活性分別為7.520±0.198 U/mgprot、5.828±0.184 U/mgprot、3.204±0.197 U/mgprot和2.031±0.176 U/mgprot。2）各實(shí)驗(yàn)組的谷胱甘肽含量經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)也是隨著冷凍保存天數(shù)的增加而顯著下降，其中V4組的谷胱甘肽