人卵母細(xì)胞玻璃化凍存的安全性與效率研究.pdf

1、成熟卵母細(xì)胞凍存是女性生育力儲(chǔ)存目前最成熟并具有前景的技術(shù)，在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域有其不可替代的優(yōu)勢(shì)，并為人類配子及胚胎發(fā)育潛能研究擴(kuò)展了研究領(lǐng)域。卵母細(xì)胞由于其自身特殊的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在冷凍復(fù)蘇過(guò)程中更易受到損傷，細(xì)胞骨架、紡錘體、膜結(jié)構(gòu)和透明帶的損傷都影響其復(fù)蘇后受精與胚胎發(fā)育的潛能。卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)誕生后十余年間一直進(jìn)展緩慢，玻璃化技術(shù)的成熟與卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)與的應(yīng)用使其在近十年有了較快發(fā)展，目前有了越來(lái)越多的應(yīng)用。

2、但因其安全性仍需更多臨床大樣本和更多基礎(chǔ)研究的論證，卵母細(xì)胞冷凍技術(shù)目前仍未成為臨床的常規(guī)操作。卵母細(xì)胞冷凍效率的提高和安全性的評(píng)估亟需開(kāi)展，以期更安全、高效地用于臨床。
　　玻璃化冷凍基本原理是通過(guò)增加溫度傳導(dǎo)的速度和冷凍保護(hù)劑的濃度，使細(xì)胞內(nèi)外液由液態(tài)轉(zhuǎn)化為類似玻璃狀的非晶體化固體狀態(tài)，形成透明的玻璃狀固體，保留細(xì)胞內(nèi)液體正常的分子和離子分布。玻璃化冷凍技術(shù)目前已被證實(shí)較慢速冷凍對(duì)于卵母細(xì)胞凍存有更高的效率，但是冷凍保護(hù)劑所需

3、的高濃度可能給細(xì)胞帶來(lái)毒性，冷凍成功的關(guān)鍵在于足夠高的降溫速率和不至于給細(xì)胞造成毒性的冷凍保護(hù)劑濃度。
　　本研究通過(guò)觀察人卵母細(xì)胞玻璃化冷凍-復(fù)蘇前后的形態(tài)測(cè)量指標(biāo)、透明帶的消化時(shí)間、ROS水平、紡錘體結(jié)構(gòu)與H1FOO表達(dá)變化研究玻璃化冷凍-復(fù)蘇過(guò)程對(duì)卵母細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子學(xué)水平的影響，進(jìn)而比較新鮮和凍融后人體外成熟的卵母細(xì)胞體外受精和胚胎發(fā)育潛能，并對(duì)凍融卵母細(xì)胞發(fā)育的囊胚進(jìn)行基因組的測(cè)序（CNV-seq）以驗(yàn)證該技術(shù)

4、在基因組水平的穩(wěn)定性和安全性，最后我們進(jìn)一步分析玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用于臨床人卵母細(xì)胞冷凍的數(shù)據(jù)，并對(duì)出生子代家庭進(jìn)行微陣列芯片比較基因組雜交（a-CGH）檢測(cè)，以期對(duì)人卵母細(xì)胞玻璃化凍存的安全性和效率有多方面、深入研究，為該技術(shù)的完善和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　第一部分：玻璃化冷凍對(duì)卵母細(xì)胞的影響及機(jī)制研究
　　目的：探索玻璃化冷凍技術(shù)對(duì)人卵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響。方法：收集常規(guī)體外受精周期中人未受精卵母細(xì)胞，在玻璃化冷凍前

5、后分別測(cè)量其形態(tài)學(xué)指標(biāo)，包括平均直徑、卵周隙大小、透明帶厚度和記錄極體完整情況，比較冷凍前后的形態(tài)學(xué)指標(biāo)的變化；將未受精卵母細(xì)胞分為新鮮組和冷凍組，比較兩組透明帶用臺(tái)式液消化所需的時(shí)間、胞漿ROS水平和H1FOO表達(dá)強(qiáng)度，收集常規(guī)體外受精周期獲得的未成熟卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后得到成熟卵母細(xì)胞，用紡錘體觀測(cè)儀觀察卵母細(xì)胞紡錘體，按紡錘體影像分為A、B、C三類，比較冷凍前后紡錘體形態(tài)變化，并進(jìn)一步對(duì)部分冷凍后的卵母細(xì)胞進(jìn)行紡錘體的熒光免疫染色，

6、激光共聚焦顯微鏡觀察其結(jié)構(gòu)。結(jié)果：（1）共測(cè)量未受精MII卵母細(xì)胞236枚，玻璃化冷凍-復(fù)蘇后存活201枚，復(fù)蘇率85.17%（201/236），復(fù)蘇后0小時(shí)卵母細(xì)胞直徑（OD）和透明帶間隙（PS）均有顯著性差異（P<0.05）,透明帶厚度（ZP）和第一極體完整率沒(méi)有明顯差異，復(fù)蘇后2小時(shí)所有卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)和冷凍前均沒(méi)有明顯差異。（2）共消化冷凍前卵母細(xì)胞50枚，冷凍復(fù)蘇2小時(shí)后卵母細(xì)胞50枚，冷凍復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞透明帶消化時(shí)間

7、顯著高于未冷凍卵母細(xì)胞（P<0.05）。（3）卵母細(xì)胞ROS水平共檢測(cè)未受精卵188枚，其中未冷凍卵母細(xì)胞42枚，冷凍復(fù)蘇后0h卵母細(xì)胞49枚，與冷凍前卵母細(xì)胞相比ROS水平明顯降低，冷凍復(fù)蘇后2h卵母細(xì)胞51枚，ROS水平明顯高于冷凍前卵母細(xì)胞，冷凍復(fù)蘇后4h卵母細(xì)胞46枚，與冷凍前卵母細(xì)胞相比ROS水平略高，但統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有明顯差異。（4）H1FOO表達(dá)檢測(cè)共檢測(cè)未受精卵母細(xì)胞104枚，均檢測(cè)到H1FOO表達(dá)，其中冷凍前卵母細(xì)胞50枚

8、，冷凍復(fù)蘇后2h卵母細(xì)胞54枚，冷凍后卵母細(xì)胞的H1FOO表達(dá)較冷凍前表達(dá)明顯減弱（P<0.05）。（5）共用紡錘體觀測(cè)儀觀察IVM后獲得的MII期卵母細(xì)胞230枚，玻璃化冷凍復(fù)蘇后共有195枚卵母細(xì)胞存活，不同紡錘體類型的卵母細(xì)胞復(fù)蘇率有顯著差異（P<0.05），冷凍前后A類卵母細(xì)胞所占比例無(wú)明顯差異。（6）共檢測(cè)IVM后的新鮮MII卵母細(xì)胞16枚，異常紡錘體2枚，冷凍復(fù)蘇后卵母細(xì)胞30枚，異常4枚，異常率占13.3%（4/30），玻

9、璃化冷凍對(duì)紡錘體結(jié)構(gòu)無(wú)影響。結(jié)論：玻璃化冷凍技術(shù)對(duì)卵母細(xì)胞的透明帶、復(fù)蘇后2hROS水平和H1FOO表達(dá)均有影響，對(duì)復(fù)蘇后2h卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)指標(biāo)和紡錘體無(wú)影響。
　　第二部分：玻璃化冷凍后卵母細(xì)胞發(fā)育潛能與囊胚CNV-seq測(cè)序
　　目的：比較人卵母細(xì)胞冷凍前后卵母細(xì)胞發(fā)育潛能，在基因組水平對(duì)冷凍-復(fù)蘇卵母細(xì)胞發(fā)育的囊胚進(jìn)行安全性檢測(cè)。方法：收集常規(guī)體外受精周期中未成熟卵母細(xì)胞，進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)后獲得成熟卵母細(xì)胞，隨機(jī)分為新

10、鮮組和冷凍組，進(jìn)行卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射授精和胚胎培養(yǎng)，比較兩組卵母細(xì)胞受精率、卵裂率和胚胎發(fā)育情況。并對(duì)冷凍組獲得的囊胚進(jìn)行基因組測(cè)序（CNV-SEQ），同時(shí)我們對(duì)未冷凍卵母細(xì)胞發(fā)育的囊胚進(jìn)行CNV-SEQ測(cè)序作為參照。結(jié)果：共獲得IVM后MII卵母細(xì)胞313枚，其中106枚未經(jīng)過(guò)玻璃化冷凍-復(fù)蘇程序直接進(jìn)行卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）授精與胚胎培養(yǎng)，207枚進(jìn)行玻璃化冷凍復(fù)蘇，存活175枚，存活率84.54%，兩組受精率卵裂率

11、均沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，胚胎可
　　用率和囊胚獲得率冷凍組明顯低于新鮮組（P<0.05），D3胚胎中卵裂球多于5細(xì)胞的胚胎數(shù)目冷凍組明顯少于新鮮組（P<0.05），而兩組碎片≥50%的胚胎所占比率無(wú)差異。對(duì)冷凍組獲得的囊胚CNV-SEQ結(jié)果顯示：8枚檢測(cè)成功的囊胚中只有1枚胚胎為異常胚胎，異常率12.5%。而對(duì)未冷凍卵母細(xì)胞受精后發(fā)育的囊胚，5枚檢測(cè)成功的囊胚中有2枚異常，異常率為40%。結(jié)論：玻璃化冷凍技術(shù)不影響卵母細(xì)胞的受精能力，但

12、是影響胚胎的發(fā)育潛能，表現(xiàn)在發(fā)育速度減慢。對(duì)于發(fā)育到囊胚的胚胎，基因測(cè)序的結(jié)果表明在基因組層面是穩(wěn)定安全的。
　　第三部分：玻璃化凍存卵母細(xì)胞的臨床應(yīng)用及子代安全性的研究
　　目的：研究統(tǒng)計(jì)玻璃化冷凍-復(fù)蘇技術(shù)在臨床實(shí)施的數(shù)據(jù)，并在基因組水平檢測(cè)卵母細(xì)胞冷凍出生子代的安全性。方法：統(tǒng)計(jì)本中心2011至2013年間卵母細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇周期臨床數(shù)據(jù)，并對(duì)出生卵母細(xì)胞冷凍子代的兩個(gè)家庭進(jìn)行全血微陣列芯片比較基因組雜交（a-CGH）檢

13、測(cè)出生子代安全性。結(jié)果：共實(shí)施卵母細(xì)胞冷凍82周期，其中取卵日無(wú)精子可用55周期，部分卵母細(xì)胞凍存23周期，生育力保存4周期，共冷凍MII期卵母細(xì)胞623枚，平均每周期冷凍7.6枚。共實(shí)施玻璃化冷凍卵母細(xì)胞復(fù)蘇45周期，共復(fù)蘇卵母細(xì)胞338枚，存活率84.19%，受精率81.23%，卵裂率92.44%，D3胚胎可用率39.54%，共移植28周期，妊娠7周期，妊娠率25%。其中取卵日無(wú)精子可用組與部分凍存卵母細(xì)胞組比較，年齡明顯偏高（P<

14、0.05）,胚胎可用率明顯偏低（P<0.05），由于例數(shù)較小，妊娠率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（19.05%vs.42.86%，P>0.05）。≤35歲組的每周期復(fù)蘇卵母細(xì)胞數(shù)與有可用胚胎周期的比率明顯高于大于35歲組，同樣由于例數(shù)較少，妊娠率沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異（27.27%vs.16.67%）。對(duì)于兩個(gè)家庭的父母和子代a-CGH分析顯示，卵母細(xì)胞冷凍復(fù)蘇后出生的子代并未出現(xiàn)新的基因變異。結(jié)論：卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存對(duì)于取卵日無(wú)精子可用和獲卵數(shù)較多