豬卵母細胞孤雌激活及玻璃化冷凍的研究.pdf

1、豬是一種有著廣闊應用前景的理想動物模型。卵母細胞體外成熟、孤雌激活及胚胎體外培養(yǎng)構(gòu)成一套有效的體外繁殖技術，可以有效解決目前豬胚胎體外生產(chǎn)效率不高等問題。卵母細胞和胚胎冷凍保存是一種有效保護動物遺傳資源的方法，利用簡便快速的玻璃化冷凍保存技術，可以建立雌性動物基因庫、保存珍稀生物資源，為其保護和保存提供了不受時間和地域限制的新途徑。本研究對影響豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)、孤雌激活、玻璃化冷凍保存的因素進行了研究，以便確立胚胎體外生產(chǎn)的最佳條

2、件以及冷凍保存方法。
　　 1.豬卵母細胞體外成熟與孤雌激活研究本試驗以屠宰場采集的豬卵巢卵母細胞為研究對象，旨在優(yōu)化豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系及孤雌激活方法。以抽吸法采集豬卵巢中直徑為2～5mm及直徑大于5mm卵泡卵母細胞，在成熟培養(yǎng)液為TCM-199(含10％FCS)+pFF+PMSG+hCG+EGF+L-半胱氨酸中培養(yǎng)44h.培養(yǎng)成熟，用透明質(zhì)酸酶去除卵丘細胞后進行孤雌激活。結(jié)果表明：當電激強度由80V/mm增大至140V

3、/mm時，死卵數(shù)逐步增加。當電壓為120V/mm時，卵裂率(58.04％)和囊胚率(16.96％)最高。繼續(xù)增大電壓表現(xiàn)為對卵母細胞的副作用增大。在電脈沖時間上，40μs組卵裂率(65.79％)和囊胚率(20.18％)最高，且顯著高于20ps組(P＜0.05)。增加電脈沖次數(shù)并沒有能提高卵裂率和囊胚發(fā)育率，反而使得死卵數(shù)有所增加，其中三次電脈沖后孤雌胚的發(fā)育能力明顯低于其它的處理組(P＜0.05)。電激活后與不同的化學激活劑聯(lián)合處理，可

4、提高孤雌激活效率。DCpulse+CHX+6-DMAP組卵裂率和囊胚率最高，達90.4％和35.6％。聯(lián)合激活雖沒有顯著提高電激活后卵裂率（P＞0.05），但與單獨使用電激活相比，囊胚率有了顯著提高（P＜0.05）。
　　 2.豬卵母細胞的玻璃化冷凍技術研究本實驗使用3種不同冷凍載體（OPS法、細管法和冷凍環(huán)法），用于豬未成熟（GV期）和體外成熟（MⅡ期）卵母細胞的冷凍保存，比較其冷凍效果.同時，對CB和紫杉醇處理在卵母細胞冷凍

5、中的作用進行研究.結(jié)果表明，GV期卵母細胞玻璃化冷凍保存后，不同冷凍載體冷凍-解凍后卵母細胞的形態(tài)正常率無顯著差異（P＞o.05）。冷凍環(huán)法冷凍卵母細胞FDA染色存活率最高(82.oo％),OPS法(72.00％)次之，細管法最低(58.00％)；冷凍環(huán)法冷凍明顯優(yōu)于OPS法和細管法(P＜0.05)。在凍后卵母細胞體外成熟率方面，冷凍環(huán)法獲得51.54％的成熟率，顯著高于細管法和OPS法（分別為28.57％和42.86％，P＜0.05）

6、。3種冷凍載體對MⅡ期卵母細胞凍后的形態(tài)正常率也無顯著影響，分別為84.18％、80.63％和70.92％,P＞0.05。從FDA染色存活率來看，冷凍環(huán)法最高，OPS法次之，細管法最低，且三者之間差異顯著（P＜0.05）.使用紫杉醇預處理后，比較其對冷凍環(huán)冷凍效果的影響。結(jié)果顯示使用1.0μmol/L紫杉醇預處理卵母細胞，冷凍后其形態(tài)完整率(89.93％)和FDA染色存活率(83.33％)都顯著高于未處理組的79.12％和70.97％(

7、P＜0.05)，繼續(xù)提高紫杉醇濃度則表現(xiàn)為對卵母細胞的毒副作用。在不同預處理時間上，預處理30min組冷凍后卵母細胞形態(tài)完整率和FDA染色存活率最高，分別達到90.21％和84.13％。預處理濃度1.0μmol/L，30min是比較合適的處理方法；紫杉醇、細胞松弛素B(CB)或兩者聯(lián)合添加能顯著提高豬成熟卵母細胞的玻璃化冷凍的效果（P＜0.05），但兩者之間沒有顯著差異（P＞0.05）
　　 3.豬卵母細胞玻璃化冷凍后超微結(jié)構(gòu)的

8、變化本試驗旨在研究豬未成熟（GV期）和體外成熟（MⅡ期）卵母細胞玻璃化冷凍后的超微結(jié)構(gòu)變化。透射電鏡觀察結(jié)果表明.豬GV期卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍解凍后，卵母細胞外側(cè)透明帶破損；卵母細胞與卵丘細胞間的連接遭到破壞，部分卵丘細胞脫離；卵丘細胞之間的連接也遭到破壞；微絨毛數(shù)量減少且變短；卵母細胞內(nèi)的脂滴都為平滑型，未見表面粗糙帶有透明條紋的脂滴.MⅡ期卵母細胞經(jīng)玻璃化冷凍解凍后，透射電鏡觀察結(jié)果顯示，冷凍后細胞內(nèi)僅能看到平滑性脂滴，且結(jié)構(gòu)遭到破