豬卵母細(xì)胞孤雌激活及玻璃化冷凍的研究.pdf

1、豬是一種有著廣闊應(yīng)用前景的理想動物模型。卵母細(xì)胞體外成熟、孤雌激活及胚胎體外培養(yǎng)構(gòu)成一套有效的體外繁殖技術(shù)，可以有效解決目前豬胚胎體外生產(chǎn)效率不高等問題。卵母細(xì)胞和胚胎冷凍保存是一種有效保護(hù)動物遺傳資源的方法，利用簡便快速的玻璃化冷凍保存技術(shù)，可以建立雌性動物基因庫、保存珍稀生物資源，為其保護(hù)和保存提供了不受時(shí)間和地域限制的新途徑。本研究對影響豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)、孤雌激活、玻璃化冷凍保存的因素進(jìn)行了研究，以便確立胚胎體外生產(chǎn)的最佳條

2、件以及冷凍保存方法。
　　 1.豬卵母細(xì)胞體外成熟與孤雌激活研究本試驗(yàn)以屠宰場采集的豬卵巢卵母細(xì)胞為研究對象，旨在優(yōu)化豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系及孤雌激活方法。以抽吸法采集豬卵巢中直徑為2～5mm及直徑大于5mm卵泡卵母細(xì)胞，在成熟培養(yǎng)液為TCM-199(含10％FCS)+pFF+PMSG+hCG+EGF+L-半胱氨酸中培養(yǎng)44h.培養(yǎng)成熟，用透明質(zhì)酸酶去除卵丘細(xì)胞后進(jìn)行孤雌激活。結(jié)果表明：當(dāng)電激強(qiáng)度由80V/mm增大至140V

3、/mm時(shí)，死卵數(shù)逐步增加。當(dāng)電壓為120V/mm時(shí)，卵裂率(58.04％)和囊胚率(16.96％)最高。繼續(xù)增大電壓表現(xiàn)為對卵母細(xì)胞的副作用增大。在電脈沖時(shí)間上，40μs組卵裂率(65.79％)和囊胚率(20.18％)最高，且顯著高于20ps組(P＜0.05)。增加電脈沖次數(shù)并沒有能提高卵裂率和囊胚發(fā)育率，反而使得死卵數(shù)有所增加，其中三次電脈沖后孤雌胚的發(fā)育能力明顯低于其它的處理組(P＜0.05)。電激活后與不同的化學(xué)激活劑聯(lián)合處理，可

4、提高孤雌激活效率。DCpulse+CHX+6-DMAP組卵裂率和囊胚率最高，達(dá)90.4％和35.6％。聯(lián)合激活雖沒有顯著提高電激活后卵裂率（P＞0.05），但與單獨(dú)使用電激活相比，囊胚率有了顯著提高（P＜0.05）。
　　 2.豬卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍技術(shù)研究本實(shí)驗(yàn)使用3種不同冷凍載體（OPS法、細(xì)管法和冷凍環(huán)法），用于豬未成熟（GV期）和體外成熟（MⅡ期）卵母細(xì)胞的冷凍保存，比較其冷凍效果.同時(shí)，對CB和紫杉醇處理在卵母細(xì)胞冷凍

5、中的作用進(jìn)行研究.結(jié)果表明，GV期卵母細(xì)胞玻璃化冷凍保存后，不同冷凍載體冷凍-解凍后卵母細(xì)胞的形態(tài)正常率無顯著差異（P＞o.05）。冷凍環(huán)法冷凍卵母細(xì)胞FDA染色存活率最高(82.oo％),OPS法(72.00％)次之，細(xì)管法最低(58.00％)；冷凍環(huán)法冷凍明顯優(yōu)于OPS法和細(xì)管法(P＜0.05)。在凍后卵母細(xì)胞體外成熟率方面，冷凍環(huán)法獲得51.54％的成熟率，顯著高于細(xì)管法和OPS法（分別為28.57％和42.86％，P＜0.05）

6、。3種冷凍載體對MⅡ期卵母細(xì)胞凍后的形態(tài)正常率也無顯著影響，分別為84.18％、80.63％和70.92％,P＞0.05。從FDA染色存活率來看，冷凍環(huán)法最高，OPS法次之，細(xì)管法最低，且三者之間差異顯著（P＜0.05）.使用紫杉醇預(yù)處理后，比較其對冷凍環(huán)冷凍效果的影響。結(jié)果顯示使用1.0μmol/L紫杉醇預(yù)處理卵母細(xì)胞，冷凍后其形態(tài)完整率(89.93％)和FDA染色存活率(83.33％)都顯著高于未處理組的79.12％和70.97％(

7、P＜0.05)，繼續(xù)提高紫杉醇濃度則表現(xiàn)為對卵母細(xì)胞的毒副作用。在不同預(yù)處理時(shí)間上，預(yù)處理30min組冷凍后卵母細(xì)胞形態(tài)完整率和FDA染色存活率最高，分別達(dá)到90.21％和84.13％。預(yù)處理濃度1.0μmol/L，30min是比較合適的處理方法；紫杉醇、細(xì)胞松弛素B(CB)或兩者聯(lián)合添加能顯著提高豬成熟卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍的效果（P＜0.05），但兩者之間沒有顯著差異（P＞0.05）
　　 3.豬卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后超微結(jié)構(gòu)的

8、變化本試驗(yàn)旨在研究豬未成熟（GV期）和體外成熟（MⅡ期）卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后的超微結(jié)構(gòu)變化。透射電鏡觀察結(jié)果表明.豬GV期卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍解凍后，卵母細(xì)胞外側(cè)透明帶破損；卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞間的連接遭到破壞，部分卵丘細(xì)胞脫離；卵丘細(xì)胞之間的連接也遭到破壞；微絨毛數(shù)量減少且變短；卵母細(xì)胞內(nèi)的脂滴都為平滑型，未見表面粗糙帶有透明條紋的脂滴.MⅡ期卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍解凍后，透射電鏡觀察結(jié)果顯示，冷凍后細(xì)胞內(nèi)僅能看到平滑性脂滴，且結(jié)構(gòu)遭到破