卵母細胞成熟抑制劑對豬卵母細胞成熟的影響.pdf

1、與牛羊等動物的體外成熟卵母細胞相比，豬卵母細胞的體外成熟質(zhì)量較差，這主要表現(xiàn)在卵母細胞的細胞質(zhì)成熟差、多精子受精率高和胚胎發(fā)育能力低。近年來，許多學(xué)者在卵母細胞體外成熟液里添加抑制劑，以此來提高體外成熟卵母細胞的成熟質(zhì)量。抑制劑對卵母細胞的核成熟率影響較小，但抑制劑能阻滯卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂，使其停留在GⅤ期，這有利于使卵母細胞的細胞核成熟和細胞質(zhì)成熟同步，另外，抑制劑能使卵母細胞的細胞核成熟時間集中，減少了老化卵母細胞的比例。本文以卵

2、母細胞內(nèi)生發(fā)泡染色質(zhì)構(gòu)型、極體出現(xiàn)比率、卵丘擴散程度和孤雌激活后卵裂率為主要檢測統(tǒng)計指標，研究了抑制劑對卵母細胞成熟、卵丘擴散和發(fā)育能力的影響，以篩選出一種能夠提高卵母細胞成熟質(zhì)量的抑制劑。試驗1：卵丘細胞狀態(tài)、卵巢保存溫度和采集時間對卵母細胞內(nèi)生發(fā)泡染色質(zhì)構(gòu)型的影響。本試驗將不同卵丘細胞狀態(tài)(完整或較差)的COCs，以及不同卵巢保存溫度(25-30℃或31-34℃)和采集時間(8-9月份或11-12月份)的COCs處理后進行熒光染色，

3、觀察其卵母細胞內(nèi)生發(fā)泡染色質(zhì)構(gòu)型。卵丘完整COCs組的GⅥ-GⅦ期卵母細胞比例極顯著高于卵丘細胞較差的COCs組(74.46﹪vs57.06﹪，P＜0.01)，但兩組間GⅤ期卵母細胞的比例差異不顯著(90.98﹪vs85.44﹪，P＞0.05)；在31-34℃中高溫保存的卵巢組，其GⅥ-GⅦ期和GⅤ期卵母細胞的比例極顯著低于25-30℃低溫保存組(45.96﹪vs74.46﹪，P＜0.01；77.62﹪vs90.98﹪，P＜0.01)；

4、除GⅥ期卵母細胞比例受卵巢采集時間影響外，不同時間采集卵巢的卵母細胞在其它各減數(shù)分裂階段的分布情況基本一致。結(jié)果表明：COCs內(nèi)卵丘細胞完整程度、卵巢保存溫度和卵巢采集時間影響了卵母細胞內(nèi)生發(fā)泡染色質(zhì)構(gòu)型，將卵巢保存于25-30℃的環(huán)境中，并選取3層以上卵丘細胞的COCs進行成熟培養(yǎng)效果較好。 試驗2：不同劑量3'，5'-cAMP抑制卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂的效果。本試驗將COCs隨機分組培養(yǎng)于含有0、0.2、0.5、1和2mmol

5、·L-13'，5'-cAMP的IVM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h后染色，并同培養(yǎng)前(0h)卵母細胞的染色情況相比較。隨著3'，5'-cAMP劑量的增加，GⅥ-GⅦ期、GⅤ期卵母細胞比例均逐漸增加(24.06﹪、31.04﹪、42.71﹪、55.30﹪、60.71﹪；38.30﹪、55.88﹪、73.97﹪、83.71﹪、86.86﹪)；卵母細胞在含2mmol·L-13'，5'-cAMP的IVM液中培養(yǎng)24h后，GⅥ-GⅦ期、GⅤ期卵母細胞比例均

6、與0h組卵母細胞差異不顯著(60.71﹪vs74.79﹪，P＞0.05；86.86﹪vs90.44﹪，P＞0.05)。結(jié)果表明：2mmol·L-1的3'，5'-cAMP能夠顯著抑制卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂，維持卵母細胞于GⅥ-GⅦ期發(fā)育階段。 試驗3：3'，5'-cAMP和不同激素添加方式對卵母細胞減數(shù)分裂進程的影響。本試驗分別于卵母細胞體外成熟的第24h、32h、40h和48h檢測卵母細胞在各減數(shù)分裂階段的分布情況。3'，5'-c

7、AMP對卵母細胞減數(shù)分裂進程的影響。在第24h時，3'，5'-cAMP組卵母細胞主要集中在GⅤ期(86.59﹪)，無抑制劑組GVBD-MII期卵母細胞的比例為55.09﹪；在第32h，3，5-cAMP組卵母細胞快速恢復(fù)減數(shù)分裂，主要分布在GVBD和MI期(46.31﹪、27.62﹪)，均與在不含抑制劑組卵母細胞差異不顯著(40.55﹪、38.60﹪，P＞0.05)；在第40h，兩組卵母細胞均主要集中在MI-A/T期，但3'，5'-cAM

8、P組A/T期卵母細胞的比例顯著高于不含抑制劑組(35.70﹪vs16.15﹪，P＜0.05)；在第48h，3'，5'-cAMP組卵母細胞的核成熟率高于不含抑制劑組，但差異不顯著(72.17﹪vs59.90﹪，P＞0.05)。結(jié)果表明：3'，5'-cAMP加速了卵母細胞的減數(shù)分裂進程。 不同激素添加方式對卵母細胞減數(shù)分裂進程的影響。在IVM+FSH+3，5-cAMP→IVM+LH中培養(yǎng)24h后的卵母細胞，其GⅥ-GⅦ期卵母細胞的比

9、例顯著低于在IVM+FSH+LH+3'，5'-cAMP→IVM中(46.09﹪vs60.06﹪，P＜0.05)，前者增加了第32h、40h、48h時GⅤ卵母細胞的比例(48.04﹪、29.19﹪、15.73﹪)，減緩了卵母細胞的減數(shù)分裂進程，極顯著降低了卵母細胞的核成熟率(43.43﹪vs72.17﹪，P＜0.01)。結(jié)果表明：在豬卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中，宜在成熟前期同時加入FSH和LH。 試驗4：不同卵母細胞成熟抑制劑對豬卵母

10、細胞減數(shù)分裂恢復(fù)、COCs中卵丘擴散程度和卵母細胞核成熟率的影響。本試驗將COCs分別在不含抑制劑和分別含有4mmol·L-1、25umol·L-1、2mmol·L-1的次黃嘌呤、Roscovitine和3'，5'-cAMP的IVM液中培養(yǎng)24h后觀察抑制劑對卵丘擴散的影響，然后熒光染色觀察抑制劑對豬卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)的影響，或于成熟培養(yǎng)的第20-22h將COCs轉(zhuǎn)入不含抑制劑和激素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)到48h，熒光染色觀察抑制劑對卵母細胞

11、核成熟率的影響。ROS顯著抑制了卵丘擴散，僅有26.37﹪的COCs發(fā)生了1-2級擴散，其余COCs均未發(fā)生擴散，不含抑制劑組、HX組和3'，5'-cAMP組COCs的卵丘擴散情況基本一致，1-2級擴散分別為(56.89﹪、52.44﹪和49.38﹪)，3-4級擴散分別為(35.34﹪、30.67﹪、35.96﹪)。與不含抑制劑組卵母細胞相比，HX、ROS和3，5-cAMP組卵母細胞均被極顯著抑制在GⅤ期(88.48﹪、87.57﹪、8

12、7.50﹪vs27.58﹪，P＜0.01)，且與0h組(88.72﹪)差異不顯著(P＞0.05)；HX和3'，5'-cAMP組GⅥ-GⅦ期卵母細胞的比例與0h組差異不顯著(78.38﹪、76.04﹪vs76.51﹪，P＞0.05)，但ROS組GⅥ-GⅦ期卵母細胞的比例(54.55﹪)極顯著(P＜0.01)低于HX、3'，5'-cAMP組和0h組。HX、ROS和3，5-cAMP組卵母細胞的核成熟率與不含抑制劑組卵母細胞核成熟率差異不顯著(

13、64.91﹪、58.52﹪、71.08﹪vs70.75﹪，P＞0.05)。結(jié)果表明：HX和3'，5'-cAMP均能可逆性地抑制卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂，且不影響卵丘擴散；ROS能抑制卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂，但降低了GⅥ-GⅦ期卵母細胞的比例，抑制了卵丘細胞的擴散。 試驗5：不同抑制劑對卵母細胞成熟培養(yǎng)后孤雌胚胎發(fā)育能力的影響。本試驗卵母細胞在無抑制劑或分別含HX、ROS和3'，5'-cAMP的IVM液中成熟后用離子霉素激活，在胚胎培養(yǎng)

14、的第2d、第5d分別觀察其卵裂數(shù)和8-cell及以上的胚胎數(shù)。3'，5'-cAMP組卵母細胞孤雌激活后卵裂率極顯著高于無抑制劑、HX和ROS組(64.99﹪vs53.08﹪、37.16﹪、35.36﹪，P＜0.01)，無抑制劑組也極顯著高于HX組和ROS組(P＜0.01)；3'，5'-cAMP組8-cell及以上孤雌胚的比例顯著或極顯著高于其余各組(31.37﹪vs23.39﹪、12.82﹪、14.10﹪)，無抑制劑組8-cell及以上

15、孤雌胚的比例顯著或極顯著高于HX和ROS組。結(jié)果表明：3'，5'-cAMP提高了卵母細胞的成熟質(zhì)量，而HX和ROS降低了卵母細胞的發(fā)育能力。 結(jié)論：(1)卵巢在25-30℃環(huán)境中保存，且卵丘完整的COCs，其GⅥ-GⅦ期卵母細胞的比例較高，適合用于體外成熟培養(yǎng)；(2)在卵母細胞的體外成熟液中3'，5'-cAMP的最佳添加劑量為2mmol·L-1；(3)HX、ROS和3'，5'-cAMP均能可逆性地抑制卵母細胞的減數(shù)分裂，對卵母細