豬卵母細(xì)胞體外成熟及胚胎培養(yǎng)的相關(guān)研究.pdf

1、為了進(jìn)一步探索建立穩(wěn)定、有效、經(jīng)濟(jì)的豬胚胎體外生產(chǎn)方案，為豬克隆平臺(tái)的優(yōu)化提供依據(jù)。本研究針對(duì)影響豬胚胎體外生產(chǎn)效率的部分關(guān)鍵環(huán)節(jié)，重點(diǎn)了研究如何提高豬卵母細(xì)胞體外成熟質(zhì)量、優(yōu)化豬胚胎體外培養(yǎng)條件。
　　 研究了不同電擊活參數(shù)，必需氨基酸和非必需氨基酸對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟與成熟后孤雌發(fā)育的影響；探索了Leptin對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟和孤雌胚胎體外發(fā)育的影響；比較了在體外培養(yǎng)過程中添加丙戊酸對(duì)豬克隆胚的影響。
　　 （1）

2、將經(jīng)過體外成熟的卵母細(xì)胞隨機(jī)分別以1.56 kv/cm、100μs、2DC；1.56 kv/cm、100μs、1DC；1.00 kv/cm、80μs、2DC三組參數(shù)進(jìn)行電激活，發(fā)現(xiàn)經(jīng)1.00 kv/cm、80μs、2DC電激活的卵母細(xì)胞，無論是胚胎的卵裂率還是囊胚率都低于1.56 kv/cm、100μs、2DC和1.56 kv/cm、100μs、1DC電激活的組（卵裂率65.77±0.31％ vs．78.90±0.19％、77.78±0

3、.18％，P<0.05；囊胚率27.71±0.39％ vs．39.98±0.38％、36.55±0.25％，P<0.05）。
　　 （2）為了探討瘦素（Leptin）對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌激活后胚胎早期發(fā)育的影響，本研究選擇在Earle's鹽緩沖的TCM199中添加10 IU/mL PMSG，10 IU/mLhCG，10 ng/mL EGF配制成化學(xué)限定的基礎(chǔ)液，添加不同濃度Leptin對(duì)豬卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)為各試驗(yàn)組

4、，以未添加Leptin的基礎(chǔ)液為對(duì)照組1，而添加5％的胎牛血清（FBS），10％豬卵泡液為對(duì)照組2。比較分析各組卵母細(xì)胞核成熟效率，孤雌激活后胚胎的卵裂率，囊胚發(fā)育率，結(jié)果表明，各添加組卵母細(xì)胞成熟率與對(duì)照組之間無顯著差異（P>0.05）；孤雌激活后，各組間的卵裂率和囊胚發(fā)育率也無明顯差異。
　　 （3）以不同濃度必需氨基酸和非必需氨基酸（1％EAA+1％NEAA，2％EAA+1％NEAA）添加到豬卵母細(xì)胞IVM培養(yǎng)液，發(fā)現(xiàn)無論

5、是成熟率還是孤雌激活后的卵裂率，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組都沒有顯著差異（P>0.05）；而胚胎的后期培養(yǎng)上，發(fā)現(xiàn)添加組（1％EAA+1％NEAA，2％EAA+1％NEAA）的囊胚率要顯著低于對(duì)照組1和2（19.07±3.15％，16.89±2.41％ vs．26.53±2.00％，27.55±1.64％，P<0.05）。
　　 （4）在胚胎培養(yǎng)液PZM-3和PZM-4中分別添加不同濃度的瘦素（10ng/mL、50ng/mL、100ng/m

6、L）發(fā)現(xiàn)處理組胚胎發(fā)育情況均優(yōu)于對(duì)照組，盡管在卵裂率和囊胚細(xì)胞總數(shù)上沒有顯著差異，但在囊胚率方面，發(fā)現(xiàn)無論是PZM-3還是PZM-4添加組都比對(duì)照組要高，且差異顯著（P<0.05），而且相對(duì)于對(duì)照組，添加50ng/mL的組囊胚率最高（PZM-3，51.23±3.48％ vs．34.37±4.03％，P<0.05； PZM-4，31.76±5.07％vs．12.14±1.89％，P<0.05）。
　　 （5）在胚胎培養(yǎng)液PZM-3

7、中添加不同濃度的VPA，發(fā)現(xiàn)添加組的卵裂率與對(duì)照組沒有顯著差別（P>0.05）；而添加組胚胎的后期均不能發(fā)育到囊胚。
　　 結(jié)果表明：①用1.56 kv/cm、100μs、2DC作為孤雌激活的電擊活參數(shù)效果最好。②在成熟液中添加Leptin對(duì)卵母細(xì)胞成熟作用不明顯，也沒有顯著提高后期胚胎發(fā)育的能力。③在成熟液中添加必需氨基酸和非必需氨基酸對(duì)于卵母細(xì)胞的成熟并不影響，但對(duì)孤雌激活胚的后期發(fā)育不利，囊胚率顯著降低。④在胚胎培養(yǎng)液中添