豬卵母細胞體外成熟及孤雌胚胎干細胞的分離培養(yǎng)初探.pdf

1、本試驗以從屠宰場采集廢棄的豬卵巢為研究材料，對卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系以及孤雌囊胚胚胎干細胞的分離培養(yǎng)進行了探究。首先以亮甲酚藍染色對成熟培養(yǎng)前的卵母細胞進行篩選，并通過添加db-cAMP來達到核質的同步成熟，進而提高卵母細胞的體外成熟質量；隨后以孤雌激活后得到的囊胚為材料，從胚齡、飼養(yǎng)層以及內(nèi)細胞團的分離幾個方面對孤雌胚胎干細胞的分離培養(yǎng)進行了探究。試驗主要結果如下：
　　1．以13、26、39、52μmol/L的亮甲酚藍(br

2、illiant cresyl blue,BCB)對成熟培養(yǎng)前的卵丘-卵母細胞復合體（COCs）染色90 min，比較不同濃度的BCB對卵母細胞的著色率、成熟率以及孤雌激活胚胎和核移植胚胎的早期發(fā)育情況。分析結果顯示，BCB濃度為26μmol/L時，經(jīng)染色的COCs既有較高的著色率，而又不影響其體外成熟的效率。挑選BCB+組卵母細胞進行孤雌激活和核移植試驗，其卵裂率和囊胚率均顯著高于BCB-組（P<0.05）。胚胎移植試驗挑選BCB+組中

3、發(fā)育較好的1~2細胞期重組胚對5頭代孕母豬進行了移植，其中2頭懷孕，1頭順利產(chǎn)下了6頭健康胎兒。
　　2．成熟培養(yǎng)液中分別添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-cAMP時，卵母細胞的成熟率隨著濃度的增加依次降低，但濃度為1 mmol/L時，孤雌激活后的囊胚率最高（27.03％）；卵丘細胞單層與卵母細胞共培養(yǎng)時，其成熟率、卵裂率及囊胚率（86.00％、89.04％、28.36％）也得到了顯著提高；0.4 mmo

4、l/L的db-cAMP和卵丘細胞單層共培養(yǎng)時，其成熟率和卵裂率（85.78％和88.95％）與對照組差異不顯著，但囊胚率（35.14％）顯著提高。
　　3．試驗研究了囊胚的胚齡、飼養(yǎng)層的種類及囊胚的不同處理對豬孤雌囊胚胚胎干細胞分離培養(yǎng)的影響。實驗結果顯示：①第8天的囊胚貼壁率（25.00％）顯著高于第7天和第9天；②以小鼠胎兒成纖維細胞為飼養(yǎng)層時貼壁率為18.52％，顯著高于豬胎兒成纖維細胞和豬子宮上皮細胞飼養(yǎng)層（P<0.05）