豬卵母細(xì)胞體外成熟及孤雌胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)初探.pdf

1、本試驗(yàn)以從屠宰場采集廢棄的豬卵巢為研究材料，對卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系以及孤雌囊胚胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)進(jìn)行了探究。首先以亮甲酚藍(lán)染色對成熟培養(yǎng)前的卵母細(xì)胞進(jìn)行篩選，并通過添加db-cAMP來達(dá)到核質(zhì)的同步成熟，進(jìn)而提高卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量；隨后以孤雌激活后得到的囊胚為材料，從胚齡、飼養(yǎng)層以及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分離幾個(gè)方面對孤雌胚胎干細(xì)胞的分離培養(yǎng)進(jìn)行了探究。試驗(yàn)主要結(jié)果如下：
　　1．以13、26、39、52μmol/L的亮甲酚藍(lán)(br

2、illiant cresyl blue,BCB)對成熟培養(yǎng)前的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）染色90 min，比較不同濃度的BCB對卵母細(xì)胞的著色率、成熟率以及孤雌激活胚胎和核移植胚胎的早期發(fā)育情況。分析結(jié)果顯示，BCB濃度為26μmol/L時(shí)，經(jīng)染色的COCs既有較高的著色率，而又不影響其體外成熟的效率。挑選BCB+組卵母細(xì)胞進(jìn)行孤雌激活和核移植試驗(yàn)，其卵裂率和囊胚率均顯著高于BCB-組（P<0.05）。胚胎移植試驗(yàn)挑選BCB+組中

3、發(fā)育較好的1~2細(xì)胞期重組胚對5頭代孕母豬進(jìn)行了移植，其中2頭懷孕，1頭順利產(chǎn)下了6頭健康胎兒。
　　2．成熟培養(yǎng)液中分別添加0、0.5、1.0、1.5和2.0 mmol/L的db-cAMP時(shí)，卵母細(xì)胞的成熟率隨著濃度的增加依次降低，但濃度為1 mmol/L時(shí)，孤雌激活后的囊胚率最高（27.03％）；卵丘細(xì)胞單層與卵母細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，其成熟率、卵裂率及囊胚率（86.00％、89.04％、28.36％）也得到了顯著提高；0.4 mmo

4、l/L的db-cAMP和卵丘細(xì)胞單層共培養(yǎng)時(shí)，其成熟率和卵裂率（85.78％和88.95％）與對照組差異不顯著，但囊胚率（35.14％）顯著提高。
　　3．試驗(yàn)研究了囊胚的胚齡、飼養(yǎng)層的種類及囊胚的不同處理對豬孤雌囊胚胚胎干細(xì)胞分離培養(yǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：①第8天的囊胚貼壁率（25.00％）顯著高于第7天和第9天；②以小鼠胎兒成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層時(shí)貼壁率為18.52％，顯著高于豬胎兒成纖維細(xì)胞和豬子宮上皮細(xì)胞飼養(yǎng)層（P<0.05）