孤雌激活人體外成熟卵母細(xì)胞和人孤雌胚胎干細(xì)胞建系的初步探討.pdf

1、人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)是指從人囊胚期分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)能在體內(nèi)長期增殖并保持未分化，同時(shí)具有多向分化潛能的一類細(xì)胞。近年來，關(guān)于hESCs誘導(dǎo)分化為表皮樣干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、造血干細(xì)胞、心肌細(xì)胞等方面的研究取得一定的進(jìn)展。成功建立的hESCs系已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的許多領(lǐng)域，它潛在的醫(yī)學(xué)應(yīng)用也成為世界范圍內(nèi)的研究熱點(diǎn)。目前，人孤雌胚胎干細(xì)胞(h

2、uman parthenogenetic embryonic stemcells，hPESCs)系的成功建立為hESCs建系提供嶄新的來源，是預(yù)防移植細(xì)胞免疫排斥的潛在方法。但是人成熟卵母細(xì)胞來源十分有限，我們試圖采用新的卵母細(xì)胞資源獲得孤雌發(fā)育的胚胎，初步探討hPESCs建系和鑒定的相關(guān)內(nèi)容。本研究在人卵母細(xì)胞來源、孤雌激活條件、hPESCs的培養(yǎng)體系的建立等方面為應(yīng)用孤雌生殖技術(shù)建立hPESCs系提供了新的思路。
　　 目的

3、：了解電脈沖聯(lián)合6-甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine，6-DMAP)孤雌激活人體外成熟卵母細(xì)胞后，獲得的孤雌胚胎的發(fā)育潛能；初步探討hPESCs的建系與鑒定工作。
　　 方法：未見第1極體排出的不成熟人卵母細(xì)胞，經(jīng)過在體外受精(in vitrofertilization，IVF)培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)，共獲得減數(shù)分裂Ⅱ期(MⅡ)成熟卵母細(xì)胞117個(gè)，隨機(jī)分兩組。處理組成熟卵母細(xì)胞予以電脈沖聯(lián)合6-DMAP孤雌激

4、活，共59個(gè)；對照組不予人工孤雌激活，共58個(gè)；對比觀察兩組活化效率和胚胎早期的體外發(fā)育效率；繼續(xù)觀察并篩選發(fā)育至囊胚階段的孤雌胚胎，機(jī)械法分離ICM，原代克隆培養(yǎng)。建立hPESCs的培養(yǎng)方法：將hPESCs接種在經(jīng)過絲裂霉素C(Mitomycin C，MMC)處理的人包皮成纖維細(xì)胞(human foreskinfibroblasts，HFF)上，培養(yǎng)基含80％KnockOut-DMEM、20％Knock-Out血清替代物(Knocko

5、ut serum replacement，KSR)及8ng/mL堿性成纖維生長因子(Basicfibroblast growth factor，bFGF)等，用0.05％胰酶(0.05％trypsin-EDTA)消化細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)傳代，經(jīng)特異性標(biāo)記物染色與核型檢測達(dá)到鑒定hPESCs的目的。
　　 結(jié)果：
　　 1、電脈沖聯(lián)合6-DMAP孤雌激活人體外成熟卵母細(xì)胞，處理組活化率為32.20％，對照組活化率為12.07％，處

6、理組活化率明顯高于對照組，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 2、處理組卵裂率為21.10％，囊胚形成率為25.00％；對照組卵裂率為57.10％，囊胚形成率為0.00％。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對于處理組和對照組的卵裂率、囊胚形成率來說，組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 3、處理組中的1個(gè)電脈沖聯(lián)合6-DMAP孤雌激活的孤雌胚胎發(fā)育至囊胚階段，分離ICM、原代培養(yǎng)并接種于HFF飼養(yǎng)層上，可以使hPESCs

7、呈克隆樣生長，命名為hPESCs-081012，利用本研究建立的hPESCs培養(yǎng)體系，體外長期擴(kuò)增超過20代，生物學(xué)鑒定符合hESCs標(biāo)準(zhǔn)。
　　 4、hPESCs特異性標(biāo)記物免疫組化染色
　　 在HFF飼養(yǎng)層上生長的hPESCs克隆，抗Oct-4抗體免疫組化染色呈綠色熒光，抗SSEA-3抗體和抗SSEA-4抗體染色呈紅色熒光，抗SSEA-1抗體染色未見明顯熒光顯色。
　　 5、堿性磷酸酶(Alkaline Ph