昆明小鼠胚胎干細(xì)胞建系的初步研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)是具有自我更新和高度分化潛能的細(xì)胞，能在體外保持未分化狀態(tài)無(wú)限增殖傳代。目前已建立了多種動(dòng)物和人的ESCs系。昆明系小鼠是我國(guó)生物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用最多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。故本試驗(yàn)以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)材料，探討了小鼠ESCs(mouse ESCs，mESCs)建系的技術(shù)方法，為實(shí)驗(yàn)室下一步研究水牛ESCs建系提供一套可行的技術(shù)理論體系。 本試驗(yàn)包括兩部分內(nèi)容，第一部分為類(lèi)mESCs分離

2、方法的研究。主要探討不同胚胎期(擴(kuò)展囊胚和孵化囊胚)和傳代方法對(duì)分離類(lèi)mESCs效率的影響。第二部分為類(lèi)mESCs鑒定的研究。包括堿性磷酸酶(AKP)染色、RT-PCR分析Oct4和Sox2表達(dá)、核型分析和分化能力鑒定。其中檢測(cè)類(lèi)mESCs分化能力又通過(guò)自發(fā)分化和bFGF誘導(dǎo)分化兩方面進(jìn)行。 結(jié)果顯示：1)擴(kuò)展囊胚分離類(lèi)mESCs效率高于孵化囊胚(P<0.05)。雖然在貼壁率和原代克隆形成率二者沒(méi)有顯著差異(P>0.05)，但在

3、孵化囊胚組未獲得類(lèi)mESCs；2)從類(lèi)mESCs生長(zhǎng)形態(tài)和AKP染色上看，5代后類(lèi)mESCs傳代使用機(jī)械法或Trypsin/EDTA消化法，對(duì)維持類(lèi)mESCs未分化狀態(tài)沒(méi)有差異，說(shuō)明無(wú)論機(jī)械法還是Trypsin/EDTA消化法都適合對(duì)類(lèi)mESCs進(jìn)行傳代；3)本實(shí)驗(yàn)獲得的類(lèi)mESCs傳至25代未見(jiàn)形態(tài)上的分化，AKP染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，RT-PCR分析顯示表達(dá)Oct4和Sox2，核型分析顯示為正常核型40XY，正常核型率為70％，說(shuō)明本試驗(yàn)分

4、離的類(lèi)mESCs具有ESCs的基本特征；4)類(lèi)mESCs在去除飼養(yǎng)層和LIF、bFGF之后，經(jīng)懸浮培養(yǎng)形成類(lèi)胚體(EB)，EB貼壁后在無(wú)LIF、bFGF下自發(fā)分化為多種類(lèi)型細(xì)胞； 在無(wú)LIF、血清以及含20 ng/mL bFGF下誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細(xì)胞；AKP染色顯示，這兩種方式分化的細(xì)胞均呈陰性；用Nestin檢測(cè)誘導(dǎo)分化，呈陽(yáng)性。說(shuō)明類(lèi)mESCs具有體外分化潛能。 綜上所述，本試驗(yàn)成功分離出類(lèi)mESCs，而且所分離的類(lèi)m