人胚胎干細胞建系、初步鑒定及應用不同方法冷凍人胚胎干細胞的研究.pdf

1、人胚胎干細胞(hESCs)是指來源于人囊胚內細胞團(ICM)或人原始生殖細胞(imordial germ cells)的多能性細胞，它在體外能無限增殖并保持正常的細胞核型，具有分化為三個胚層的各種組織的潛能。hESCs系的建立對再生醫(yī)學、藥理學及基礎科學研究具有深遠的應用價值。目前，許多研究機構都在進行hESC建系的相關研究工作。大多數生殖中心在進行體外受精．胚胎移植(IVF-ET)時通常使用D<,3>的胚胎進行移植，移植后常有許多剩余

2、質量差的廢棄胚胎，將這些D<,3>廢棄胚胎收集起來進行培養(yǎng)，部分胚胎可發(fā)育成囊胚，本實驗利用這些囊胚的內細胞團，以人胚胎肺組織成纖維細胞(HEPFs)作為飼養(yǎng)層，進行了hESC建系及鑒定的初步研究。還有一部分患者已妊娠分娩成功，她們自愿簽署知情同意書，將其多余的冷凍胚胎用于科學研究，本實驗將這些胚胎解凍后進行培養(yǎng)，部分也可發(fā)育成囊胚，對其也進行了hESCs建系及鑒定的相關研究。hESCs建系成功后的另一個重要環(huán)節(jié)就是細胞的有效凍存，本實

3、驗采用慢速冷凍、玻璃化冷凍及程序降溫冷凍三種不同方法凍存同一代數的hESCs，并將解凍后hESCs的細胞復蘇率、克隆生長及分化情況進行對比分析，同時對解凍后的hESCs的全能性進行了鑒定。 第一部分，應用體外受精廢棄胚胎建立hESCs系；第二部分，對所建立hESCs系的鑒定；第三部分，hESCs低溫凍存方法比較。 本實驗共收集了177個D3廢棄胚胎，形成囊胚47個；解凍胚胎23個，形成囊胚7個。hESCs系的建立與囊胚的

4、質量和ICM所形成的原代克隆的生長情況密切相關，質量好的囊胚分離培養(yǎng)獲得的hESCs傳代效率高，原始生長速度快的ICM所形成的原代克隆傳代效率高。將來源于優(yōu)質囊胚的ICM接種于飼養(yǎng)層后已經建立了4個hESCs系，分別命名為hESCs-060909、 hESCs-060927、hESCs-061005和hESCs-061124，其中hESCs-061124來源于解凍胚胎形成的優(yōu)質囊胚。 hESCs系的鑒定包括對hESCs的細胞形態(tài)、表面標

5、記物(alkaline phosphatase， TRA-1-60，TRA-1-81，SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4)及核型的鑒定。對 hESCs-060909 P<,20>，hESCs-060927P<,15>，hESCs-061124 P<,6>進行了AKP檢測，克隆呈紫紅色陽性反應。對hESCs-060909 P<,20>和hESCs-060927 P<,15>進行了免疫組化檢測：未分化的hESCs克隆SSEA-1不著色

6、，呈陰性反應；SSEA-3染色較淺，呈部分陽性反應；SSEA-4染色深，呈陽性反應；TRA-1-60呈陽性反應。對 hESCs-060909 P<,20>進行了核型檢測，核型為46，XY，表明其具有正常的二倍體核型；對hESCs-060927 P<,15>進行了核型檢測，核型為46，XX，表明其具有正常的二倍體核型。 本實驗探討了三種不同方法冷凍保存hESCs的效率。將傳統(tǒng)慢速冷凍、玻璃化冷凍及程序降溫冷凍三種方法凍存的hESC

7、s解凍后進行比較，分析了不同方法對hESCs的細胞復蘇率、克隆生長和分化情況的影響。用機械法將培養(yǎng)皿中同一細胞系同代的hESCs進行分離，共獲得93個相似大小的hESCs細胞團塊，將其分為三組凍存：31個進行慢速冷凍，31個進行玻璃化冷凍，其余31個進行程序化冷凍。一周后將凍存的hESCs解凍，對不同凍存方法的hESCs復蘇率(復蘇率=回收細胞團塊數目/冷凍細胞團塊數目)進行對比：玻璃化法組復蘇率為35.5％，程序化冷凍組復蘇率為16.

8、1％，慢速冷凍組的復蘇率為12.9％。其中玻璃化法組與慢速冷凍組相比較，有統(tǒng)計學意義，認為玻璃化法能更有效的保存人胚胎干細胞。其余兩兩比較，均無統(tǒng)計學意義。也將應用三種凍存方法解凍后的hESCs的細胞形態(tài)，克隆生長和分化情況進行了對比，玻璃化法組比其它兩組的hESCs形態(tài)好，克隆生長速度較快且不易分化。最后，對解凍后的hESCs的全能性進行了鑒定，三組解凍后的hESCs核型分析正常，AKP陽性，SSEA-1陰性，SSEA-3部分陽性，S