人廢棄胚胎來源的胚胎干細胞建系研究.pdf

1、目的：人胚胎干細胞起源于囊胚內細胞團,具有無限自我更新及體內外分化成人體任何一種細胞類型的能力,胚胎干細胞全能性特征可為細胞替代治療及藥物篩選提供大量資源。人胚胎干細胞系1998年就已建立,但是胚胎干細胞系的發(fā)育潛能和表觀遺傳特性存在很大差異,導致用于人體移植治療時會出現(xiàn)HLA免疫排斥問題。國內干細胞株數(shù)遠不能滿足HLA匹配數(shù),還需要建大量不同胚胎來源的干細胞株。在大部分IVF胚胎室,受精卵通常培養(yǎng)至第3天(D3),所有胚胎經形態(tài)學評分

2、后,高評分胚胎用于移植或冷凍,低評分胚胎由于發(fā)育潛能不足,序貫培養(yǎng)獲得囊胚著床率低、死亡率及染色體異常率高,通常予以丟棄。盡管形態(tài)學評分目前是大多數(shù)生殖中心的胚胎判斷標準,但并不是胚胎發(fā)育潛能的金標準。本研究收集 D3低質量廢棄胚胎,序貫培養(yǎng)至 D6,囊胚擴張后(3級及以上)行玻璃化冷凍,凍融后培養(yǎng)至D8或D9接種,本研究在常規(guī)建系方法基礎上進行了改進,嘗試用D6天低質量凍融囊胚進行干細胞建系,為人廢棄胚胎干細胞建系提供材料和方法學參考

3、。
　　方法：(1)囊胚序貫培養(yǎng)、冷凍:本實驗開始前已獲得安徽醫(yī)科大學倫理委員會的同意,并且所有提供廢棄胚胎的夫婦均已簽署知情同意書,同意其廢棄胚胎用于科研。收集本中心D3廢棄胚胎行序貫培養(yǎng),獲得的囊胚玻璃化冷凍儲存。
　　(2)胚胎解凍、培養(yǎng):胚胎解凍后序貫培養(yǎng)至D8或D9,觀察囊胚形態(tài)變化,對含有內細胞團的存活囊胚進行接種。
　　(3)接種、傳代:接種之前鏈蛋白酶消化去除透明帶,機械打孔成功后接種,待原代集落長出后

4、,將原代集落接種至事先準備好的小鼠飼養(yǎng)層上,7天傳代一次。(4)胚胎干細胞特征鑒定:分別取不同代次的胚胎干細胞行堿性磷酸酶染色,干細胞體內外分化,免疫組化熒光染色以及染色體核型分析。
　　結果：(1)囊胚形成率:共收集168枚低形態(tài)學評分的D3廢棄胚胎,參照Steer CV的評分標準,所有胚胎的單胚胎評分均小于16分。序貫培養(yǎng)至D6天共獲得低質量囊胚(包括3CB,3BC,4CB,4CC)32枚,復蘇后存活26枚,囊胚形成率19.0

5、％,復蘇存活率81.3%。
　　(2)復蘇、接種后生長狀況:復蘇后存活的囊胚26枚,均含有不同形狀大小的內細胞團,分離出原代克隆8個,其中2個在傳代過程中分化,其余2個原代克隆準備傳第2代時出現(xiàn)污染。我們從一個4CB及3BC的囊胚成功分離培養(yǎng)出hESC,其中1株已傳36代,另一株已傳20代。
　　(3)hESC的生物學特性分析:傳代過程中的干細胞集落表現(xiàn)出典型的干細胞克隆特征,細胞間連結緊密,與周圍飼養(yǎng)層細胞形成明顯的界限;

6、堿性磷酸酶 AKP染色強陽性;間接免疫熒光著色,干細胞集落高表達OCT-4抗體;完整干細胞集落免疫表型分析顯示細胞集落TRA-1-60、TRA-1-81、SSEA-3、SSEA-4表達陽性。D26,D36染色體核型分析均為正常二倍體核型,46XX。干細胞集落接種到SCID小鼠腹股溝皮下,10周后形成的畸胎瘤可見3個胚層的細胞,包括角化復層扁平上皮(外胚層)、軟骨(中胚層)以及腸腺上皮(內胚層);胚胎干細胞克隆集落體外懸浮培養(yǎng)14天后形成