豬胚胎來(lái)源干細(xì)胞建系方法的初步研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESC）和滋養(yǎng)層干細(xì)胞(trophoblast stem cells，TSC)均屬于胚胎來(lái)源的干細(xì)胞，由早期胚胎或內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(inner cell mass，ICM)培養(yǎng)而來(lái)。胚胎干細(xì)胞已經(jīng)在小鼠、人、猴子和大鼠上成功建系，滋養(yǎng)層干細(xì)胞也已經(jīng)在小鼠、人、兔子和猴上成功建立。但無(wú)論是胚胎干細(xì)胞還是滋養(yǎng)層干細(xì)胞，在有蹄類大動(dòng)物上均未取得成功。由于豬在體型和相關(guān)生理功能方面都與人類十

2、分接近，所以豬胚胎干細(xì)胞和滋養(yǎng)層干細(xì)胞是研究人類相關(guān)基因疾病以及異種移植的最佳模型。本研究初步摸索豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞的建系方法;同時(shí)構(gòu)建高表達(dá)白血病抑制因子(leukemia inhibitor factors，LIF)的飼養(yǎng)層細(xì)胞，并構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體，以期提高豬胚胎干細(xì)胞的質(zhì)量及建系效率。
　　目的:
　　通過(guò)接種體外受精囊胚，建立豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞系;建立高效表達(dá)豬LIF的STO細(xì)胞系，優(yōu)化豬胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)條件;構(gòu)建豬

3、源轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體，輔助豬胚胎干細(xì)胞建系。
　　方法:
　　1.通過(guò)接種體外受精囊胚，建立豬滋養(yǎng)層干細(xì)胞系:通過(guò)體外受精和發(fā)育培養(yǎng)獲得第6天囊胚，去除透明帶后將全胚接種于STO飼養(yǎng)層上，用FGF系統(tǒng)干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)滋養(yǎng)層干細(xì)胞，并利用機(jī)械切割的方法進(jìn)行傳代，通過(guò)形態(tài)學(xué)和堿性磷酸酶染色方法鑒定其干細(xì)胞特性。
　　2.通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的技術(shù)，將已構(gòu)建的豬LIF基因真核表達(dá)載體pCAG-pLIF轉(zhuǎn)染至小鼠STO細(xì)胞中，通過(guò)藥物

4、篩選獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)豬LIF的轉(zhuǎn)基因STO細(xì)胞（STO-pLIF細(xì)胞）。通過(guò)QPCR、Western blot等方法檢測(cè)STO-pLIF細(xì)胞中豬LIF的表達(dá)量。選擇高效表達(dá)豬LIF的STO-pLIF細(xì)胞作為飼養(yǎng)層，培養(yǎng)大鼠誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞(induced pluripotency stem cells，iPS)。通過(guò)生長(zhǎng)曲線檢測(cè)、堿性磷酸酶染色、干細(xì)胞多能因子的RT-PCR檢測(cè)和免疫熒光染色等方法，檢驗(yàn)STO-pLIF細(xì)胞飼養(yǎng)層在大鼠i

5、PS細(xì)胞培養(yǎng)方面的功能。
　　3.以豬胚胎成纖維細(xì)胞(pig embryonic fibroblast，PEF)的eDNA為模板，合成或擴(kuò)增豬源OCT4、TBX3、REX1、LIN28、DPPA5五個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，利用PCR方法，將REX1、LIN28、DPPA5以E2A和T2A序列連接成3因子片段并通過(guò)測(cè)序檢測(cè)其準(zhǔn)確性，將商業(yè)構(gòu)建的OCT4和TBX3以及自行構(gòu)建的三因子片段分別經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切后連接到誘導(dǎo)表達(dá)載體pTRE3G-Z

6、sGreenI中，獲得三個(gè)重組表達(dá)載體。為了驗(yàn)證所構(gòu)建質(zhì)粒功能，將豬源OCT4重組表達(dá)載體和pEFla-Tet3G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入PEF細(xì)胞中，并在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)添加強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)外源轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，通過(guò)QPCR檢測(cè)載體中豬源OCT4的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.所建立的滋養(yǎng)層干細(xì)胞系最高傳代至第9代，逐漸出現(xiàn)較多油滴，無(wú)法繼續(xù)傳代;由于傳代受限，無(wú)法有效擴(kuò)增細(xì)胞系，后續(xù)的核型鑒定和堿性磷酸酶染色結(jié)果均不理想。
　　2

7、.獲得豬LIF轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性STO細(xì)胞系，STO-pLIF細(xì)胞中LIF基因和蛋白的表達(dá)量均有上調(diào);該細(xì)胞系作為飼養(yǎng)層所培養(yǎng)的大鼠iPS細(xì)胞在形態(tài)、多能性因子表達(dá)方面更接近于含LIF的傳統(tǒng)培養(yǎng)液培養(yǎng)的大鼠iPS細(xì)胞，顯著優(yōu)于無(wú)外源LIF添加的培養(yǎng)液所培養(yǎng)的大鼠iPS細(xì)胞。
　　3.成功構(gòu)建豬源轉(zhuǎn)錄因子重組表達(dá)載體，在豬源OCT4重組表達(dá)載體與pEF1a-Tet3G質(zhì)粒共轉(zhuǎn)PEF細(xì)胞并經(jīng)DOX誘導(dǎo)表達(dá)后，利用QPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其有效提高了P