Apodemus sylvaticus胚胎干細胞的建系和生物學特性的研究.pdf

1、胚胎干細胞來源于胚胎時期囊胚的內(nèi)細胞團，是一種多潛能的干細胞，能在體外進行長期的自我更新，在體內(nèi)外可以分化為三個胚層來源的各種細胞類型，因而在基礎(chǔ)研究和臨床治療中都有很好的應用前景。Apodemussylvaticus是一種嚙齒類動物，與小鼠在進化方面兩者差距比較大，與大鼠和小鼠之間的遺傳差距相近。本研究建立了了Apodemussylvaticus的胚胎干細胞系，命名為AS-ES1，具有24對染色體，能在體外長期培養(yǎng)傳代中保持未分化狀態(tài)

2、，在體外自然分化能形成胚體，注射于裸鼠皮下能形成畸胎瘤。該細胞系表達多種多能性的分子標記，包括堿性磷酸酶、Oct-4、Nanog和Rex-1，但是不表達ssea-1，ssea-3，ssea-4，Tra-1-60和GCTM-2。本研究還成功將GFP和ds-RED兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細胞系，同時細胞仍保持增殖和分化潛能，并用RNA干擾技術(shù)滅活上述兩種基因在細胞內(nèi)的表達，證明該細胞系能進行基因操作。AS-ES的建立為Apodemussylvatic

3、us發(fā)育和遺傳的研究提供重要的工具，使Apodemussylvaticus有望成為研究基因功能的新的模式動物。 本實驗包括兩個部分：1、Apodemussylvaticus胚胎干細胞系的建立2、Apodemussylvaticus胚胎干細胞系的生物學特性分析第一部分Apodemussylvaticus胚胎干細胞系的建立材料和方法 1.1動物飼養(yǎng)Apodemussylvaticus的飼養(yǎng)條件于小鼠相似，包括飲食、溫度等。

4、 1.2胚胎干細胞系的建立使用7-9周的Apodemussylvaticus進行交配。取受精后3.5天母鼠的子宮，用M2培養(yǎng)液沖洗并收集囊胚，然后接種于預先接種好的放射后的小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養(yǎng)層細胞的24孔板中。囊胚在培養(yǎng)1-2天后，胚胎會從透明帶孵出，內(nèi)細胞團明顯增殖長大，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天，然后挑取增殖的內(nèi)細胞團消化吹打成單個細胞，接種于新的飼養(yǎng)層細胞上。4-7天后即可以觀察到未分化的胚胎干細胞克隆的生長。培養(yǎng)條件為37℃

5、，5％CO2和95％濕度。 結(jié)果從受精3.5天的母鼠子宮中獲得5個囊胚，其中的一個幾天后長出大量的類似小鼠胚胎干細胞的克隆。這些克隆成圓形，邊界清楚?？寺?nèi)的細胞排列緊密，核漿比例高，有明顯的核仁，命名為AS-ES1。 白血病抑制因子和飼養(yǎng)層細胞能夠保持培養(yǎng)細胞的未分化狀態(tài)，這與小鼠的胚胎干細胞類似。 結(jié)論成功從嚙齒類動物Apodemussylvaticus的囊胚獲得了一種新的胚胎干細胞系，它能在體外長期傳代培養(yǎng)

6、，細胞形態(tài)特征與小鼠胚胎干細胞類似。 第二部分Apodemussylvaticus胚胎干細胞系的生物學特性分析 材料和方法2.1生長曲線生長曲線是評估細胞生長特性的有效工具，從生長曲線可以確定群體倍增時間。以0.6×105/ml的密度接種于六孔板，每12小時消化細胞進行計數(shù)。以E14細胞株作為對照。 2.2干細胞標記的表達為了檢測該細胞的堿性磷酸酶活性，將細胞固定于4％的多聚甲醛/PBS，用堿性磷酸酶的底物BCI

7、P/NBT進行染色。為了進行免疫細胞化學的檢測，用下列一抗進行孵育，包括SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60，GCTM-2，orOCT4，然后用FITC標記二抗與一抗結(jié)合，最后用DARPI對樣品進行染色，在熒光顯微鏡下觀察。用RT-PCR檢測各種基因得表達。首先從胚胎干細胞提取RNA，用Sensiscript逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補得CDNA，然后用PCR擴增目的基因。目的基因和其引物序列如下：Oct4，Nanog，Rex

8、1，陽性對照用GAPDH。 2.3核型分析和性別鑒定染色體的準備如下：在胚胎干細胞的培養(yǎng)液中加入0.1mg/ml的秋水仙素溫育一個小時，然后胰酶消化，用0.075MKCl溶液重懸室溫下放置20分鐘，再在甲醇/乙酸混合液(3∶1)中固定一個小時，然后置于玻片上。分散的染色體用1％的姬姆薩染料染色然后拍片，至少要數(shù)20個出于分裂中期的分散染色體和分析5條G帶的核型。 該細胞株的性別通過PCR的方法鑒定，目的基因是基因組DNA

9、的Y染色體相關(guān)基因Tspy，陽性對照用X染色體相關(guān)基因PolA1以及Gapdh。 2.4體內(nèi)外分化能力的檢測 體外分化：胚胎干細胞消化成單個細胞后接種于不貼壁的培養(yǎng)皿，使用不含白血病抑制因子的培養(yǎng)液，培養(yǎng)兩周后可見大量胚體形成。然后將胚體接種于貼壁的組織培養(yǎng)皿進行誘導分化。所得到的分化細胞用如下幾種抗體進行檢測：內(nèi)胚層albumin，中胚層desmin，外胚層nestin，GFAP和Tuj1，然后用Cy3羊抗鼠的二抗進行

10、標記。 體內(nèi)分化：為了檢測其畸胎瘤的形成能力，取1-2x106未分化的胚胎干細胞注射于4-8周大小的裸鼠皮下，注射后8周取出畸胎瘤用4％的多聚甲醛進行固定，常規(guī)石蠟切片和HE染色。 2.5質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染用于轉(zhuǎn)染的兩種質(zhì)粒為pTP6-hrGFP和pTP6-DsRed2，分別表達綠色和紅色熒光蛋白。兩種質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶SCA-1進行線性化。轉(zhuǎn)染后的細胞先用無抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)48小時，再加入puromycin(終濃度為2

11、ug/ml)進行篩選。篩選7天后挑取抗puromycin的克隆進行胰酶消化，然后接種與新的飼養(yǎng)層細胞上進行培養(yǎng)。 2.6RNA干擾在進行RNA干擾時，先將轉(zhuǎn)染hrGFP的細胞以較低的密度接種于6孔板中，然后用Lipofectamine2000將雙鏈的siRNA轉(zhuǎn)染至細胞內(nèi)，進行GFP基因的干擾，設(shè)立陰性對照。24小時后再用Lipofectamine2000進行第二次轉(zhuǎn)染。 結(jié)果2.1生長曲線所測得的AS-ES1的群體倍增

12、時間為12小時，而E14為17小時，說明該細胞的增殖速度更快。 該細胞已經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)傳代半年(P80)，其細胞形態(tài)和增殖速度都沒有明顯的改變。 2.2染色體分析和性別鑒定取P24，P63和P80代數(shù)的AS-ES1細胞進行核型分析，結(jié)果為48條染色體為正常核型，表明該細胞可在體外長期培養(yǎng)同時保持核型的穩(wěn)定。 核型分析觀察到類似Y染色體的存在。設(shè)計PCR實驗擴增Y染色體相關(guān)基因Tspy，證實該細胞含有Y染色體，其核型為

13、48(X，Y)。 2.3干細胞分子標記的表達絕大多數(shù)細胞表達堿性磷酸酶。檢測Oct4，SSEA-1，SSEA-3，SSEA-4，Tra-1-60和GCTM-2的表達，只有Oct4為陽性。最后，用RT-PCR方法檢測Oct4，Nanog和Rex1，發(fā)現(xiàn)三種標記均為陽性。 2.4分化能力體外分化：Apodemussylvaticus胚胎干細胞在沒有飼養(yǎng)層細胞和白血病抑制因子的條件下，在不貼壁的培養(yǎng)皿培養(yǎng)時可見有胚胎體形成。將

14、胚體接種于貼壁的組織培養(yǎng)皿，從胚體生長出來的細胞在形態(tài)上有明顯的異質(zhì)性。用免疫細胞化學的方法可以檢測到三個胚層來源的細胞類型。 體外分化：取出畸胎瘤進行石蠟切片和HE染色。結(jié)果可見三個胚層的細胞類型，如內(nèi)胚層的呼吸道上皮，腺上皮和腸上皮，中胚層的脂肪和肌肉，外胚層的皮膚細胞和神經(jīng)元。 2.5質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染pTP6-hrGFP和pTP6-DsRed2這兩種質(zhì)粒都帶有puromycin的抗性基因，轉(zhuǎn)染后用puromycin篩

15、選一段時間，挑取若干能夠穩(wěn)定表達熒光蛋白的克隆繼續(xù)擴增，選取其中的兩個克隆作進一步的分析(AS-ES1-GFP1和AS-ES1-DsRed1)。這兩株細胞在體外培養(yǎng)傳代(超過15代)仍然保持典型的未分化狀態(tài)，生長正常而且熒光表達也沒有減弱，還能產(chǎn)生帶有熒光的胚胎體和畸胎瘤，通過胚層特異分子標記檢測可見存在有三個胚層的細胞。 2.6RNA干擾選取能穩(wěn)定表達綠色熒光蛋白的AS-ES1-GFP1細胞株，將特異干擾GFP編碼RNA的si