豬體外成熟卵母細(xì)胞ICSI及原核形成影響因素研究.pdf

1、本論文包括三部分研究內(nèi)容。第一部分，豬體外成熟卵母細(xì)胞孤雌激活或ICSI后，比較不同激活方案對(duì)激活或ICSI胚胎體外發(fā)育能力的影響，以優(yōu)化ICSI后的激活方案。第二部分，在第一部分研究基礎(chǔ)上，將還原型谷胱甘肽連同精子一同注射入卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，研究外源谷胱甘肽對(duì)ICSI胚胎體外發(fā)育能力的影響。第三部分，進(jìn)一步比較不同精子處理方法對(duì)ICSI胚胎體外發(fā)育能力的影響，以優(yōu)化ICSI技術(shù)體系。研究結(jié)果如下： 第一部分研究不同激活方案對(duì)豬IC

2、SI胚胎發(fā)育能力的影響。實(shí)驗(yàn)1比較電激活后間隔不同時(shí)間用化學(xué)物質(zhì)處理對(duì)豬孤雌激活胚胎發(fā)育能力的影響。研究結(jié)果表明卵母細(xì)胞電激活后隨著時(shí)間的延長，第二極體排出率逐漸升高，卵母細(xì)胞激活后間隔3h和4h，大部分卵母細(xì)胞均排出第二極體(60.94％和78.95％)，與其它兩組差異顯著(P<0.05)。間隔不同時(shí)間，卵裂率和囊胚細(xì)胞數(shù)均無顯著差異(P>0.05)，但是隨著間隔時(shí)間的延長，囊胚率顯著降低。間隔3h后囊胚率為34.36％，間隔4h后為

3、21.11％，差異顯著(P<0.05)，間隔0h和間隔2h囊胚率無顯著差異(P>0.05)；通過對(duì)囊胚進(jìn)行核型分析，結(jié)果顯示間隔0h和間隔2h，50％以上的囊胚均為二倍體，第二極體沒有排出，差異不顯著(P>0.05)。間隔3h后，孤雌胚單倍體比例顯著升高，間隔4h后幾乎全部囊胚均為單倍體，差異顯著(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)2比較電激活后間隔不同時(shí)間用化學(xué)物質(zhì)處理對(duì)豬ICSI胚胎體外發(fā)育能力的影響。結(jié)果表明：①電激活后間隔0h與間隔4h IC

4、SI胚胎激活率差異顯著(59.09％vs 87.23％)(P<0.05)，間隔3h ICSI胚胎激活率與其他兩組無顯著差異(P>0.05)。②電激活后間隔4h再用DMAP處理，ICSI胚胎卵裂率顯著低于其他兩組的卵裂率(56.53％vs89.49％和79.58％)(P<0.05)。⑨間隔不同時(shí)間ICSI胚胎的囊胚率與囊胚細(xì)胞數(shù)雖無顯著差異(P>0.05)，但間隔3h后ICSI胚胎的囊胚率仍略高于其他兩組，因此以下的實(shí)驗(yàn)中我們均采用IGI

5、胚胎電激活后間隔3h再用DMAP處理作為激活方案。實(shí)驗(yàn)3比較不同激活方案對(duì)豬ICSI胚胎體外發(fā)育能力的影響。結(jié)果表明ICSI胚胎電激活后間隔3h再用DMAP或U0126處理6h受精率、卵裂率及囊胚率均無顯著差異(P>0.05)。用U0126處理6h較用U0126處理4h可以顯著提高受精率(P<0.05)，用U0126處理6h與處理8h正常受精率無顯著差異(P>0.05)，三組間卵裂率及囊胚率均無顯著差異，但處理6h組較其它兩組稍高；因此

6、ICSI胚胎較好的激活方案為電激活后間隔3h再用DMAP或U0126處理6h。 第二部分研究將精子連同谷胱甘肽一同注射入豬體外成熟卵母細(xì)胞對(duì)胚胎發(fā)育能力的影響。結(jié)果表明將谷胱甘肽連同精子一同注入與單獨(dú)注射精子相比，卵母細(xì)胞激活率無顯著差異(81.54％vs 85.71％，P>0.05)，且形成2個(gè)極體2個(gè)原核比例也無顯著差異(47.69％vs 41.43％， P>0.05)。卵裂率與囊胚細(xì)胞數(shù)均無顯著差異(85.72％vs 90

7、.26％，47.46 vs 48.01，P>0.05)，但囊胚率差異顯著(16.58％ vs 29.10％，P<0.05)，注入谷胱甘肽后顯著降低囊胚發(fā)育率。對(duì)囊胚進(jìn)行核型分析，結(jié)果顯示兩者間二倍體和單倍體形成比例均無顯著差異(P>0.05)，有70％的囊胚為正常二倍體。說明將還原型谷胱甘肽注射入卵母細(xì)胞質(zhì)不能提高ICSI胚胎的發(fā)育能力。 第三部分研究不同精子處理方法對(duì)ICSI胚胎體外發(fā)育能力的影響。①精子用不同化學(xué)藥物處理后經(jīng)

8、流式細(xì)胞儀檢測，結(jié)果表明精子用不同化學(xué)藥物處理后各組間aT的平均值均存在顯著差異(250.9±2.3、229.1±5.4、597.7±7.7、263.2±4.4和578.3±9.0，P<0.05)。隨著aT值升高，COMPaT值也升高，精子用DTr或DTr+肝素處理后SD aT值(176.5±2.4和180.1±7.0 vs 84.3±11.0、85.1±9.3、88.2±8.7，P<0.05)和COMP aT 值均顯著高于其他三組(2

9、9.5±0.6和36.2±10.9 vs 3.7±0.6、7.0±0.8、12.2±2.4，P<0.05)。其他三組間SD aT值和COMP aT值均無顯著差異(P>0.05)。對(duì)照組、GSH組和GSH+肝素組綠色熒光分布的平均值顯著低于其他兩組(481.7±25.5、470.8±5.0和537.8±5.4 vs 645.9±8.5、849.8±78.1，P<0.05)，DTT組和DTr+肝素組綠色熒光分布的平均值也存在顯著差異(P<0

10、.05)。②精子用不同化學(xué)藥物處理后ICSI胚胎后期發(fā)育能力研究結(jié)果表明各組間激活率無顯著差異(P>0.05)，但正常受精率差異顯著，精子用GSH孵育120min組形成2個(gè)極體2個(gè)原核的比例顯著高于對(duì)照組及用DTT處理組(62％ vs 33.33％和38.78％，P<0.05)，與肝素+谷胱甘肽處理組和肝素+DTT處理組無顯著差異(P>0.05)。ICSI胚胎卵裂率無顯著差異(P>0.05)，囊胚發(fā)育率存在顯著差異，用谷胱甘肽處理組囊胚

11、發(fā)育率顯著高于對(duì)照組、DTT組和肝素+DTT組(40.21％ vs 19.60％、25.96％、28％，P<0.05)，與肝素+谷胱甘肽組無顯著差異(40.21％ vs 32.26％，P>0.05)。肝素+谷胱甘肽組囊胚發(fā)育率顯著高于對(duì)照組(32.26％ vs 19.60％，P<0.05)，而與其他組無顯著差異(P>0.05)，DTT組與對(duì)照組囊胚率無顯著差異(25.96％ vs19.60％，P>0.05)。肝素+DTT組囊胚細(xì)胞數(shù)顯著

12、高于其他四組(54.05 vs 44.71、38.96、42.32、38.92，P<0.05)，其他組間囊胚細(xì)胞數(shù)無顯著差異(P>0.05)。對(duì)受精卵進(jìn)行染色體分析，結(jié)果表明盡管各組間無顯著差異(P>0.05)，但DTT處理組以及肝素+DTT組染色體損傷程度較對(duì)照組和谷胱甘肽處理組高，染色體均出現(xiàn)小片段或大片段的損傷，而對(duì)照組、谷胱甘肽處理組以及肝素+谷胱甘肽處理組染色體損傷程度均比較小。對(duì)囊胚進(jìn)行核型分析，結(jié)果顯示DTT處理組所形成囊