玻璃化冷凍對(duì)人體外成熟卵母細(xì)胞微絲分布及發(fā)育潛能的影響.pdf

1、隨著輔助生殖技術(shù)的廣泛開(kāi)展，卵母細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)越來(lái)越受到關(guān)注，玻璃化冷凍成為卵母細(xì)胞冷凍保存的主要技術(shù)之一。而經(jīng)過(guò)冷凍復(fù)蘇后如何獲得更高的移植率和臨床受精率成為許多生殖中心關(guān)注的焦點(diǎn)。玻璃化冷凍的損傷尤其是對(duì)超微結(jié)構(gòu)的冷凍損傷成為各實(shí)驗(yàn)室研究的重點(diǎn)，它也成為卵母細(xì)胞冷凍成敗的關(guān)鍵。近年來(lái)，許多科研中心相繼研究了玻璃化冷凍對(duì)動(dòng)物卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的冷凍損傷如微管、紡錘體結(jié)構(gòu)和發(fā)育潛能、皮質(zhì)顆粒、線(xiàn)粒體、胞內(nèi)膜電位等。而關(guān)于人類(lèi)卵母細(xì)胞超

2、微結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究相對(duì)缺乏。鑒于此，本研究主要討論了玻璃化冷凍對(duì)體外成熟卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)—微絲的影響，對(duì)比分析了冷凍前后卵母細(xì)胞微絲分布的變化;同時(shí)按照冷凍后不同的復(fù)蘇時(shí)間對(duì)各組卵母細(xì)胞微絲形態(tài)的恢復(fù)情況進(jìn)行了比較分析，選出最佳的復(fù)蘇時(shí)間并在最佳時(shí)間內(nèi)對(duì)玻璃化冷凍前后的卵母細(xì)胞行胞漿內(nèi)單精子注射(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI)，進(jìn)一步分析了玻璃化冷凍對(duì)人體外成熟卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響。

3、　　第一部分玻璃化冷凍對(duì)人體外成熟卵母細(xì)胞微絲分布的影響
　　[目的]通過(guò)對(duì)體外成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后不同復(fù)蘇時(shí)間和新鮮卵母細(xì)胞的染色分析，發(fā)現(xiàn)冷凍對(duì)微絲分布的影響及復(fù)蘇的最佳時(shí)間。
　　[方法]收集未成熟卵母細(xì)胞(GV/MⅠ)，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)為成熟卵母細(xì)胞，隨機(jī)分為新鮮組和玻璃化冷凍組，玻璃化冷凍組按不同的復(fù)蘇時(shí)間再次隨機(jī)分為復(fù)蘇后1h，2h，3h，4h組。所有卵母細(xì)胞用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽行微絲染色，之后用激光共聚焦顯微

4、鏡(LSM780)觀(guān)察。
　　[結(jié)果]經(jīng)過(guò)冷凍復(fù)蘇后卵母細(xì)胞成活率為87.37％。新鮮組卵母細(xì)胞微絲分布的正常率為71.11％，復(fù)蘇1h、2h、3h、4h后卵母細(xì)胞微絲分布正常率分別為34.15％、44.18％、69.05％、65.79％。與新鮮組相比，復(fù)蘇后1h、2h均具有顯著性差異(P＜0.01，P=0.02)，復(fù)蘇后3h、4h均無(wú)顯著性差異（P=1.00，P=0.64），1h、2h之間與3h、4h之間相比均無(wú)顯著性差異(P=

5、0.35，P=0.81)。
　　[結(jié)論]玻璃化冷凍復(fù)蘇過(guò)程改變了人體外成熟卵母細(xì)胞的微絲分布，但是經(jīng)過(guò)恰當(dāng)?shù)膹?fù)蘇時(shí)間后微絲分布可恢復(fù)至新鮮狀態(tài)，繼續(xù)增加復(fù)蘇時(shí)間并不會(huì)增加卵母細(xì)胞微絲分布的正常率。說(shuō)明合適的冷凍復(fù)蘇（約3h以上）并未改變體外成熟卵母細(xì)胞的微絲分布。
　　第二部分玻璃化冷凍對(duì)人體外成熟卵母細(xì)胞發(fā)育潛能的影響
　　[目的]通過(guò)對(duì)比分析體外成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍前后發(fā)育潛能的變化，結(jié)合第一部分?jǐn)M從超微結(jié)構(gòu)方面

6、尋找玻璃化冷凍對(duì)人體外成熟卵母細(xì)胞發(fā)育潛能影響的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。
　　[方法]收集人未成熟(GV/MⅠ)卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟為MⅡ期卵母細(xì)胞。將獲得的MⅡ期卵母細(xì)胞按隨機(jī)化原則分組，分為新鮮組和玻璃化冷凍組。將所有卵母細(xì)胞均行卵母細(xì)胞漿內(nèi)單精子注射，觀(guān)察體外成熟卵母細(xì)胞的受精數(shù)、卵裂數(shù)、優(yōu)胚數(shù)及囊胚形成數(shù)。
　　[結(jié)果]新鮮組2PN率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率分別為73.08％、23.08％、19.23％、6.73％，玻璃