褪黑素緩解老化卵母細胞體外受精后發(fā)育受阻的研究.pdf

1、高齡婦女接受體外受精（IVF）治療后的成功率明顯偏低。其中，卵母細胞老化造成的胚胎發(fā)育能力下降，是導致高齡婦女體外受精后妊娠率低、流產(chǎn)率高的重要原因。因此，尋找能夠緩解老化卵母細胞 IVF后發(fā)育受阻的方法具有重要的意義。
　　本實驗以過氧化氫（H2O2）處理小鼠卵母細胞建立的氧化應激誘導老化模型為研究對象，研究氧化應激誘導卵母細胞老化后線粒體的相關特征受損與老化卵母細胞 IVF后胚胎發(fā)育率及質量下降的關系。繼而，以老化卵母細胞囊胚

2、發(fā)育率和囊胚質量為主要評價指標，并輔于線粒體功能狀態(tài)，考察褪黑素改善老化卵母細胞IVF胚胎發(fā)育率及質量的可行性，為提高臨床高齡女性IVF成功率提供實驗依據(jù)。
　　本研究分別利用10μM、50μM、100μM和150μM不同濃度的H2O2處理MII期卵母細胞3 h，建立以氧化應激為特征的卵母細胞老化模型，以未經(jīng)H2O2處理的卵母細胞為對照。各組卵母細胞進行標準的 IVF后，觀察發(fā)育效率。結果顯示，隨H2O2濃度的增加，卵母細胞中的氧

3、化應激程度是明顯加劇的。經(jīng)150μM H2O2處理的卵母細胞IVF后，碎裂率相比對照組顯著性升高（7.77±4.78％vs.39.32±9.14%，P<0.05）；100μM H2O2處理后2細胞率相比對照組顯著降低（45.63±2.6%vs.54.67±8.27%，P<0.05）；當IVF胚胎發(fā)育至囊胚階段時，50μM、100μM處理組囊胚率分別為26.27±0.06%、28.46±3.45%，均顯著低于對照組（34.9±1.77%，

4、P<0.05）。這說明老化卵母細胞中的氧化應激，可能會對IVF后胚胎產(chǎn)生持續(xù)的影響，造成發(fā)育損傷。
　　在許多細胞類型中，老化往往伴隨著明顯的線粒體功能損傷，因此我們對H2O2誘導卵母細胞老化的線粒體功能進行了專門的檢測?；钚跃€粒體特異性標記探針Mitotracker Red結果顯示老化卵母細胞內活性線粒體豐度明顯減少；類似地，通過對線粒體基因組（mtDNA）拷貝數(shù)的絕對定量檢測，發(fā)現(xiàn)隨著 H2O2處理濃度的升高，卵母細胞 mtD

5、NA拷貝數(shù)呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；此外，使用JC-1探針對線粒體膜電位（MMP）檢測結果顯示，10~100μM濃度下表現(xiàn)出MMP升高的趨勢，即超極化現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是凋亡早期特征性事件，意味著老化卵母細胞已經(jīng)啟動了凋亡的發(fā)生。
　　老化卵母細胞中氧化應激對 IVF胚胎的持續(xù)影響，提示這一過程是可恢復的。因此，我們嘗試在體外培養(yǎng)階段（IVC）添加褪黑素（MT），通過清除附植前胚胎中的活性氧來緩解老化卵母細胞IVF后的發(fā)育損傷。選取了較為溫

6、和的100μM H2O2濃度誘導卵母細胞老化，分別在培養(yǎng)液中添加10-5 M、10-7 M、10-9 M三個濃度的褪黑素，評價老化卵母細胞IVF后發(fā)育效率和發(fā)育質量。結果顯示，與老化組（20.87±4.11%）相比，培養(yǎng)液中添加10-9 M褪黑素可以顯著恢復囊胚率（29.42±2.39%），達到與青年卵相當?shù)陌l(fā)育水平（38.76±9.43%）。而10-5 M和10-7 M褪黑素添加則未能改善囊胚率（19.87±2.88%、23.35±6

7、.03%）。這些結果表明IVF后培養(yǎng)階段添加低濃度的褪黑素可以有效恢復和改善老化卵母細胞IVF后的發(fā)育能力。接下來發(fā)現(xiàn)10-5 M、10-7 M、10-9 M褪黑素添加后，囊胚細胞數(shù)分別為28.30±10.42%、31.54±9.97%、39.36±9.78%，均與 H2O2處理老化組（37.91±4.25%）差異不顯著。進一步，囊胚凋亡檢測結果提示，10-9 M褪黑素添加有降低老化卵IVF囊胚細胞凋亡率的趨勢，但差異不顯著（2.57%

8、 vs.3.18%）。我們意外地發(fā)現(xiàn)，10-5 M褪黑素會顯著增加囊胚細胞凋亡率（6.97%vs.3.18%, P<0.05），提示高濃度的褪黑素添加會有細胞毒害作用。mtDNA定量結果顯示，10-9 M褪黑素添加組與H2O2處理老化組相比，能夠顯著恢復8細胞階段mtDNA拷貝數(shù)。
　　結論：
　　1）100μM H2O2誘導卵母細胞老化，卵母細胞內線粒體相關特征受損明顯，其中線粒體中 ROS水平顯著升高，活性線粒體豐度和