線粒體功能與卵母細胞體外成熟、受精及發(fā)育潛能的關系研究.pdf

1、本研究分為兩部分。
　　第一部分.控制性超促排卵(COH)和體外成熟(IVM)過程對卵母細胞線粒體的功能與分布影響的研究
　　 目的：
　　 過高的卵子損失率仍是當前人類輔助生殖技術(ART)所面臨的最大問題。細胞質成熟是卵子正常受精和發(fā)育的關鍵，細胞質成熟不全或滯后于核的成熟被認為是ART周期卵子發(fā)育潛能低下的重要原因。在卵子成熟過程中，胞漿中線粒體發(fā)生了劇烈變化，正常的線粒體結構和功能狀況是細胞質成熟的標志。

2、ART周期中，控制性超促排卵(COH)和卵子體外成熟(IVM)過程恰好與胞漿線粒體急劇變化的時期相重合。那么，COH和IVM這兩個非生理性卵子成熟過程是否會對卵子線粒體的功能狀況產生影響，進而干擾細胞質成熟進程?以及COH/IVM過程對卵子線粒體功能狀況的影響是否就是造成ART周期卵子高損失率或低發(fā)育潛能的重要原因?對此，本研究以小鼠為動物模型，模擬人類COH和IVM周期操作，通過分析成熟卵子線粒體的空間分布、DNA(mtDNA)拷貝數

3、、氧化磷酸化(OXPHOS)功能，以及與線粒體功能密切相關的活性氧(ROS)水平和細胞骨架結構完整性，來評估非生理性COH/IVM過程對線粒體的數量、功能、分布及卵子質量的影響，為探索人類ART周期卵子低發(fā)育潛能和高損失率的機制提供新的思路。
　　 方法：
　　 將實驗小鼠隨機分為控制性超促排卵(COH)、體外成熟(IVM)和自然周期(NC)對照三個小組。小鼠COH和IVM培養(yǎng)過程盡量參照人ART周期中相應的操作方案。收

4、集各組成熟卵子，分別檢測mtDNA拷貝數、線粒體膜電位強度、ATP含量、線粒體分布、ROS水平及紡錘體與染色體結構正常率，以評估COH和IVM這兩個常用ART方案對線粒體的功能狀況和卵子質量的影響。
　　 結果：
　　 1.在COH組和NC組卵子之間，除線粒體分布和ROS水平以外，所有其它檢測指標均存在著顯著差異，即COH組卵子的平均mtDNA拷貝數、線粒體膜電位強度、ATP含量和紡錘體與染色體結構正常率均顯著低于NC組

5、卵子的相應指標(P<0.05)。
　　 2.在IVM組與NC組卵子之間，mtDNA拷貝數、ROS水平和紡錘體與染色體結構正常率存在著顯著差異，即IVM組卵子mtDNA拷貝數和紡錘體與染色體結構的正常率顯著低于NC組卵子的(P<0.05)，而IVM組的胞漿總ROS水平和線粒體特異性ROS水平顯著高于NC組的(P<0.05)。線粒體膜電位、ATP含量和線粒體分布在IVM組與NC組之間，無顯著意義的差別(P>0.05)。
　　

6、 結論：
　　 1.非生理性COH和IVM過程可顯著影響卵子線粒體的功能，以及與之密切相關的ROS水平和紡錘體/染色體結構，繼而可能影響卵子細胞質的成熟進程。
　　 2.外源Gn刺激會顯著降低COH組卵子的mtDNA的拷貝數、線粒體膜電位強度、ATP含量和紡錘體/染色體結構正常率。
　　 3.IVM過程會顯著降低卵子的mtDNA拷貝數和紡錘體/染色體結構正常率，并且還會顯著增加ROS的生成。但IVM過程對線粒體膜

7、電位強度和ATP含量沒有顯著意義的影響。
　　 4.需要進一步的研究以分析線粒體功能狀況影響卵子成熟、受精和發(fā)育的具體效應和機制。
　　 第二部分卵母細胞成熟過程中線粒體的氧化磷酸化和DNA復制功能對卵母細胞質量及發(fā)育潛能影響的研究
　　 在卵母細胞成熟過程中，胞漿中線粒體發(fā)生了劇烈變化，而線粒體的功能被證實與卵母細胞的成熟、受精和發(fā)育潛能密切相關。但迄今為止，對于線粒體是以何種機制影響卵母細胞的質量和發(fā)育潛能仍

8、存在著爭議。有研究認為，線粒體的數量或DNA(mtDNA)拷貝數是影響卵母細胞成熟、受精和發(fā)育潛能的關鍵；另有研究則認為，氧化磷酸化(OXPHOS)功能才是線粒體影響卵母細胞成熟、受精和胚胎發(fā)育潛能的主要機制。
　　 目的：
　　 在卵母細胞成熟過程中，采用獨立的線粒體功能抑制劑分別抑制線粒體的OXPHOS功能和DNA復制功能，建立線粒體功能抑制模型，分析線粒體功能抑制對卵母細胞成熟、質量、受精和發(fā)育潛能的影響，以明確線

9、粒體對卵母細胞的影響的機制。
　　 方法：
　　 在小鼠體外成熟培養(yǎng)液中引入不同濃度的羰基氰4-(三氟甲氧基)苯腙(FCCP，10和100nM)或2’，3’-雙脫氧胞苷(ddC，10和100μM)，分別抑制線粒體的OXPHOS功能和DNA復制功能。經體外14小時成熟培養(yǎng)，收集卵母細胞，檢測各組成熟卵母細胞的mtDNA拷貝數、線粒體膜電位強度和ATP含量，以評估FCCP和ddC線粒體功能抑制模型的效果。統(tǒng)計卵母細胞的生發(fā)泡

10、破裂(GVBD)發(fā)生率和細胞核成熟率，分析線粒體功能抑制對卵母細胞體外成熟的影響，并通過卵母細胞線粒體的空間分布、ROS水平、紡錘體和染色體結構來評估線粒體功能抑制對卵母細胞質量的影響。最后，統(tǒng)計分析卵母細胞體外受精率、囊胚形成率及擴張期囊胚總細胞計數，以評估線粒體功能抑制對卵母細胞受精能力和胚胎發(fā)育潛能的影響。
　　 結果：
　　 1、體外添加FCCP可有效降低卵母細胞的線粒體膜電位和ATP含量(P<0.05)，但對m

11、tDNA拷貝數無顯著意義的影響(P>0.05)；添加ddC可以使卵母細胞的mtDNA拷貝數降低約50％(P<0.05)，但對線粒體膜電位和ATP含量沒有顯著意義的影響(P>0.05)。
　　 2、FCCP處理組和ddC處理組的GVBD發(fā)生率與對照組的相比，均無顯著意義的差異(P>0.05)。FCCP的10和100 nM兩濃度處理組的細胞核成熟率分別為55.8％和47.3％，顯著低于對照組的62.9％(P<0.05)；ddC兩處理

12、組的細胞核成熟率與對照組的相比，無顯著意義的差異(P>0.05)。
　　 3、FCCP的10和100 nM處理組，線粒體呈均勻分布的卵母細胞的比例分別為66.2％和54.4％，均顯著低于對照組的78.2％(P<0.05)；ddC兩處理組線粒體呈均勻分布的比例與對照組相比，無顯著意義的差異(P>0.05)。
　　 4、除FCCP100 nM處理組的紡錘體結構正常率(SP)外，FCCP處理組卵母細胞的紡錘體和染色體結構的其它

13、檢測指標均顯著低于對照組(P<0.05)；除ddC10μM-組的紡錘體結構正常率(SP)和染色體正常率(CS)外，ddC處理組紡錘體和染色體結構其它檢測指標均顯著低于對照組(P<0.05)。
　　 5、FCCP兩濃度處理組的胞漿總ROS水平和線粒體特異性ROS水平均顯著低于對照組的(P<0.05)；ddC處理組的卵母細胞ROS水平也有所下降，但與對照組相比，無顯著意義的差異(P>0.05)。
　　 6、FCCP和ddC處

14、理對卵母細胞的體外受精能力均沒有顯著意義的影響(P>0.05)。
　　 7、FCCP的10和100nM兩處理組的囊胚形成率分別為57.8％和41.9％，ddC10和100μM兩處理組的囊胚形成率分別為46.6％和37.6％，FCCP和ddC各濃度處理組的囊胚形成率均顯著低于對照組的68.1％(P<0.05)，但各組擴張期囊胚的總細胞數目間無顯著意義的差別(P>0.05)。
　　 結論：
　　 1.線粒體的OXPH

15、OS功能和DNA復制功能抑制對卵母細胞的成熟、質量和發(fā)育均具有嚴重的影響，但兩者對卵母細胞所產生的效應并不相同。
　　 2.線粒體的OXPHOS功能抑制對卵母細胞的核成熟、線粒體的空間分布、紡錘體/染色體結構及胚胎發(fā)育潛能均產生了不利影響，但對卵母細胞的成熟啟動和體外受精能力沒有直接影響。
　　 3.線粒體DNA復制功能抑制主要對遠期的胚胎發(fā)育潛能產生影響，但對卵母細胞體外成熟、線粒體分布、ROS生成和受精能力沒有顯著意