MiR-34a通過Wnt-β-catenin信號通路影響神經(jīng)母細胞瘤細胞增殖及凋亡.pdf

1、目的:
　　應用文獻檢索和生物信息庫預測,尋找miR-34a參與調控Wnt/β-catenin信號通路的線索。通過分子生物學技術在神經(jīng)母細胞瘤細胞(SK-N-SH細胞)中過表達miR-34a,而后檢測Wnt/β-catenin信號通路活性的變化,以及腫瘤細胞增殖和凋亡的情況。為闡明miR-34a和Wnt/β-catenin信號通路在神經(jīng)母細胞瘤發(fā)病機制中的作用提供依據(jù),也為進一步研究神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生的分子機制和基因治療方法提供新的

2、思路和實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、檢索相關文獻資料并應用生物信息學方法——靶基因預測軟件(PicTar、Target Scan、microRNA.org、RNA22)預測并分析可能調控Wnt/β-catenin信號通路的microRNA,同時預測miR-34a潛在的靶基因。
　　2、構建miR-34a的模擬物并將其轉入SK-N-SH細胞中,再以半定量反轉錄PCR(RT-PCR)、熒光定量PCR(Real-time

3、PCR)檢測miR-34a在細胞中的表達情況。
　　3、在SK-N-SH細胞中過表達miR-34a后,蟲熒光素報告實驗分析Wnt1和catenin-δ-1的mRNA轉錄活性,以及β-catenin/TCF的轉錄活性;蛋白免疫印記法(Western-blot)檢測Wnt/β-catenin信號通路中關鍵蛋白(Wnt1、β-catenin、Cyclin D)的表達水平;免疫共聚焦顯微鏡觀察β-catenin核轉位情況。
　　4、

4、在SK-N-SH細胞中過表達miR-34a后,采用MTT法檢測腫瘤細胞增殖情況,并運用流式細胞分析細胞凋亡情況。
　　結果:
　　1、經(jīng)過文獻查閱以及PicTar、Target Scan、microRNA.org、RNA22四種軟件共同預測,miR-34a可能參與調控Wnt/β-catenin信號通路,catenin-δ-1為miR-34a潛在靶基因。
　　2、RT-PCR及Real-time PCR證實構建的miR-

5、34a模擬物能使miR-34a在SK-N-SH細胞中過表達。
　　3、在SK-N-SH細胞中過表達miR-34a后Wnt1和catenin-δ-1的mRNA轉錄活性,以及β-catenin/TCF的轉錄活性均受到抑制;Wnt/β-catenin信號通路中關鍵蛋白(Wnt1、β-catenin、Cyclin D)的表達水平下降;同時,β-catenin的核轉位也受阻。
　　4、在SK-N-SH細胞中過表達miR-34a后,腫瘤

6、細胞增殖水平下降,細胞凋亡增多。以對照組SK-N-SH細胞為參照,實驗組細胞在第24h、48h和72h的細胞生長抑制率分別為40.8％、20.9%和18.2%;實驗組細胞在第24h、48h和72h的細胞凋亡率分別為對照組的2.09、2.25和1.77倍。
　　結論:
　　在神經(jīng)母細胞瘤細胞(SK-N-SH細胞)中過表達miR-34a,miR-34a可以通過Wnt/β-catenin信號通路的經(jīng)典途徑,抑制腫瘤細胞增殖、誘導細