生長分化因子11對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞增殖及TGF-β-Smads和Wnt-β-Catenin信號通路的影響.pdf

1、目的：通過體外分離培養(yǎng)胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞（Neural Stem Cells，NSCs），研究生長分化因子11（Growth Differentiation Factor11，GDF11）對其增殖的影響，并通過對Smad2/3，Smad4及β-Catenin等蛋白表達(dá)的檢測探討GDF11對神經(jīng)干細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）/Smads信號通路和Wnt/β-Catenin信號通路的調(diào)控作用。
　　方法：提取孕14天的CD1胎鼠大

2、腦側(cè)腦室下區(qū)（Subventricular Zone,SVZ）的神經(jīng)干細(xì)胞并傳代培養(yǎng)。采用免疫熒光法檢測巢蛋白（Nestin）、SOX2蛋白的表達(dá)以及在誘導(dǎo)分化后鑒定NeuN和GFAP蛋白的表達(dá)來鑒定所提取細(xì)胞。CCK-8法按一定濃度梯度初步研究GDF11對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響并確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。取第三代處于對數(shù)生長期的細(xì)胞隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組添加GDF11蛋白（終濃度50ng/ml）,對照組添加等體積培養(yǎng)液。EdU法檢測兩組

3、細(xì)胞增殖情況，然后于蛋白添加后1h和6h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blotting，WB）檢測Smad2/3，Phospho(P)-Smad2/3，Smad4，β-Catenin等蛋白的表達(dá)并分析結(jié)果，統(tǒng)計(jì)學(xué)采用SPSS19.0軟件，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：1.神經(jīng)干細(xì)胞分離和體外培養(yǎng)：細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，倒置顯微鏡下觀察可見大量圓形透亮細(xì)胞呈懸浮生長，隨

4、時(shí)間推移逐漸形成多細(xì)胞球。約3~5d后細(xì)胞球中央發(fā)暗，提示需進(jìn)行傳代。
　　2.神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定：免疫熒光結(jié)果提示本實(shí)驗(yàn)中分離培養(yǎng)的細(xì)胞90%以上呈Nestin和SOX2陽性。誘導(dǎo)分化后，部分細(xì)胞呈NeuN和GFAP陽性，證明了其分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的潛能，故本實(shí)驗(yàn)中提取分離的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞，符合實(shí)驗(yàn)要求。
　　3. CCK-8細(xì)胞增殖檢測：結(jié)果顯示12ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、2

5、00ng/ml組細(xì)胞增殖率均高于對照組，但各組間差異并不明顯，400ng/ml組和800ng/ml組細(xì)胞的增殖明顯受到抑制。決定采用50ng/ml作為本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組的處理濃度。
　　4. EdU細(xì)胞增殖檢測：EdU細(xì)胞增殖染色結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組在加入GDF11因子后6h，細(xì)胞增殖率(EdU+/DAPI+)大于對照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說明GDF11促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。
　　5. Western Bl

6、otting結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組Smad2/3蛋白的相對表達(dá)量在1h和6h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)與對照組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；實(shí)驗(yàn)組的P-Smad2/3蛋白相對表達(dá)量在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均大于對照組，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組Smad4表達(dá)在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)均大于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1h組P<0.01;6h組 P<0.05），兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組β-Catenin蛋白的表達(dá)均大于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。說明在GDF11的作用下，Smad2/3