Wnt-β-catenin信號(hào)通路對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性作用研究.pdf

1、目的：不同濃度氯化鋰(LiCl)作用A549細(xì)胞或利用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)干擾A549細(xì)胞β-catenin的表達(dá)從而激活或抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，觀察細(xì)胞增殖、克隆形成、遷徙及耐藥能力等腫瘤干細(xì)胞特性的改變，并且觀察肺癌干細(xì)胞標(biāo)記物OCT-4的表達(dá)變化，從而探討Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞腫瘤干細(xì)胞特性的作用并初步探討其作用機(jī)制。
　　 方法：A549細(xì)胞經(jīng)不用濃度的LiCl

2、作用不同時(shí)間，選定最佳條件，觀察其對(duì)Wnt/β-catenin通路的激活作用；β-catenin干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，觀察其對(duì)細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制作用；觀察指標(biāo)：噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析、克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞克隆形成率、Millicell小室遷徙實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞的遷徙能力、藥物敏感實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞耐藥能力的改變、實(shí)時(shí)(real time)PCR法及western blot蛋白印

3、跡法檢測(cè)干細(xì)胞標(biāo)記OCT-4基因及蛋白水平表達(dá)的改變，研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活與抑制對(duì)上述指標(biāo)的作用。
　　 結(jié)果：經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定LiCl的最佳作用濃度為10mmol/L，最佳作用時(shí)間為24h。A549細(xì)胞經(jīng)10mmol/LLiCl作用24h后，與對(duì)照組相比，蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示β-catenin的蛋白水平表達(dá)增加(1.240±1.220vs0.987±0.903，P＜0.05)，免疫組化顯示β-catenin的

4、表達(dá)出現(xiàn)胞漿內(nèi)積聚及向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，realtimePCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶基因cyclinD1表達(dá)上調(diào)(0.023±0.006vs0.007±0.003，P＜0.05)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活；Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活后，A549細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，增殖率為32.24％，G0-G1期細(xì)胞明顯減少[(63.3±3.205)％vs(79.81±1.5)％，P＜0.01]，S期細(xì)

5、胞增多[(32.866±3.631)％vs(19.513±2.508)％，P＜0.01]，克隆形成率增加[(22.875±2.115)％vs(11.455±4.274)％，P＜0.01]，穿過(guò)Millicell小室底膜的細(xì)胞數(shù)明顯增多(52.5±4.041vs27.250±2.500，P＜0.01)，對(duì)順鉑的耐藥能力在所檢測(cè)藥物濃度均有不同程度的增強(qiáng)，OCT-4基因(0.073±0.012vs0.017±0.006，P＜0.01)及蛋白

6、(0.920±0.182vs0.335±0.064，P＜0.01)表達(dá)水平均上調(diào)；β-catenin干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，real timePCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-cateninmRNA表達(dá)明顯下降(0.002±0.001vs0.023±0.002，P＜0.01)，同時(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路的靶基因cyclinDlmRNA表達(dá)下調(diào)(0.005±0.002vs0.042±0.004，P＜0.05)，此信號(hào)通路被抑制：Wnt/β

7、-catenin信號(hào)通路抑制后，細(xì)胞的增殖能力降低，增殖抑制率為20.29％，G0-G1期細(xì)胞明顯增多[（86.釷2.6）％vs（73.8±0.9）％，P＜0.01]，S期及G2-M期細(xì)胞減少，克隆形成率降低[（31.6±7.7）％vs（46.9±7.3）％，P＜0.05]，穿過(guò)Millicell小室底膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少(16.0±3.8vs32.7±3.1，P＜0.01)，對(duì)順鉑的耐藥能力降低，OCT-4基因[(0.016±0.011

8、)vs(0.043±0.032),P＜0.05]及蛋白[(0.28±0.078)vs(0.555±0.088),P＜0.05]表達(dá)水平均下調(diào)。
　　 結(jié)論：A549細(xì)胞經(jīng)10mmol/LLiCl作用24h，可激活細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)通路；Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可促進(jìn)A549細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)克隆形成、遷徙及耐藥能力等腫瘤干細(xì)胞特性增強(qiáng)，肺癌干細(xì)胞標(biāo)記OCT-4的基因及

9、蛋白表達(dá)均增加；β-catenin干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞可抑制細(xì)胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑；Wnt/β-catenin信號(hào)通路的抑制可使細(xì)胞發(fā)生G0-G1期阻滯，抑制細(xì)胞增長(zhǎng)，同時(shí)克隆形成、遷徙及耐藥等腫瘤干細(xì)胞特性受抑制，肺癌干細(xì)胞標(biāo)記物OCT-4的基因及蛋白表達(dá)均降低。以Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑為靶點(diǎn)，抑制此通路在肺腺癌中的活化及其靶基因的表達(dá)，可能成為肺癌分子靶向治療并有可能是針對(duì)肺癌干細(xì)胞治療的新