Wnt-β-Catenin信號(hào)通路對(duì)正常和腫瘤性肝前體細(xì)胞活化的調(diào)節(jié).pdf

1、本研究分為二部分： 一、經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在大、小鼠肝前體細(xì)胞活化中的調(diào)節(jié)作用 研究背景和目的： 肝臟是是人體最大的外分泌器官,具有極強(qiáng)的再生功能。在正常生理狀態(tài)下或輕度肝損傷時(shí),肝細(xì)胞參與增殖和分化,維持肝臟的正常功能。當(dāng)出現(xiàn)廣泛和慢性的肝損傷導(dǎo)致肝細(xì)胞大量破壞和丟失而且肝細(xì)胞的增殖能力被抑制時(shí),肝臟通過前體細(xì)胞的增殖和分化來完成肝臟再生。肝前體細(xì)胞同時(shí)表達(dá)肝系標(biāo)志物和膽系標(biāo)志物,并且能夠向肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞

2、分化。肝前體細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)參與一系列肝臟損傷性疾病,并且在肝纖維化和肝臟腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。 β-Catenin既是細(xì)胞連接的重要組成部分,又是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵信號(hào)分子。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在眾多組織中是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移的重要通路,在肝臟的各種生物學(xué)功能中同樣發(fā)揮著重要作用。β-Catenin對(duì)于胚胎肝臟發(fā)育和肝切除術(shù)后的肝臟再生至關(guān)重要。在多種肝臟腫瘤,尤其是肝細(xì)胞癌中,普遍存在β-catenin

3、在細(xì)胞漿的聚集和/或核轉(zhuǎn)位。但是,Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肝前體細(xì)胞活化中的重要作用依然尚未明確。 本研究擬首先通過建立大、小鼠肝前體絀胞活化動(dòng)物模型,觀察在前體細(xì)胞活化過程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的變化情況；繼而結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn),觀察經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的激活對(duì)肝前體細(xì)胞的活化或其參與肝臟再生能力的影響,從而從體內(nèi)、體外兩個(gè)水平證實(shí)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)前體細(xì)胞的活化具有調(diào)節(jié)作用。

4、實(shí)驗(yàn)方法： 1、建立大鼠肝前體細(xì)胞活化模型； 2、用免疫組織化學(xué)和Western Blot等方法研究在大鼠肝前體細(xì)胞活化過程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的變化情況； 3、通過體外培養(yǎng)的肝前體細(xì)胞樣細(xì)胞系研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路的過度激活對(duì)細(xì)胞增殖特性的影響； 4、運(yùn)用細(xì)胞移植的實(shí)驗(yàn)研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路的過度激活對(duì)前體細(xì)胞參與肝再生能力的影響； 5、建立小

5、鼠肝前體細(xì)胞活化模型； 6、通過免疫組織化學(xué)和染色質(zhì)免疫共沉淀的方法研究在小鼠肝前體細(xì)胞活化過程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的變化情況； 7、通過質(zhì)粒注射的方法從體內(nèi)水平研究Wnt/β-catenin信號(hào)通路的過度激活對(duì)前體細(xì)胞活化的影響。 結(jié)果： 1、在大鼠肝前體細(xì)胞活化過程中,伴隨Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的升高； 2、大鼠肝前體細(xì)胞具有更高的Wnt/β-catenin

6、信號(hào)通路活性； 3、Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活不僅能在體外促進(jìn)肝前體細(xì)胞樣細(xì)胞系的增殖,而且能促進(jìn)其參與肝臟再生的能力； 4、在小鼠肝前體細(xì)胞活化過程中,伴隨Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的升高,并且小鼠肝前體細(xì)胞同樣具有更高的Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性； 5、通過質(zhì)粒注射的方法提高Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性能促進(jìn)肝前體細(xì)胞的活化。 結(jié)論： 本研究在大

7、鼠和小鼠兩種肝前體細(xì)胞活化模型中研究了Wnt/β-catenin信號(hào)通路的重要作用,不僅發(fā)現(xiàn)了在肝前體細(xì)胞活化中伴隨著Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性的顯著升高,而且發(fā)現(xiàn)肝前體細(xì)胞具有較高的Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性。更重要的是發(fā)現(xiàn)提高前體細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活性,能夠促進(jìn)前體細(xì)胞的活化及其參與肝再生的能力。 二、Wnt/β-Catenin信號(hào)通路對(duì)OV6+肝癌前體細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

8、背景和目的: 干細(xì)胞代表著具有自我更新能力、能分化為子代細(xì)胞來修復(fù)組織的一個(gè)數(shù)量非常少的細(xì)胞亞群。在許多實(shí)體腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中存在干/前體細(xì)胞起源和腫瘤細(xì)胞等級(jí)模型,具備自我更新能力的干/前體細(xì)胞可能是眾多腫瘤的起源。隨著肝干細(xì)胞生物學(xué)的進(jìn)展,人們認(rèn)為在肝細(xì)胞癌中也存在著腫瘤干/前體細(xì)胞,并且他們與肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。 Wnt/β-catenin信號(hào)通路在眾多組織中是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移的重要通路,與造血干細(xì)胞、神經(jīng)

9、干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞等眾多組織來源的干細(xì)胞的功能維持密切相關(guān)。在肝臟,Wnt/β-catenin信號(hào)通路與肝臟發(fā)育中的細(xì)胞增殖、肝再生和腫瘤生長也存在緊密聯(lián)系,但其在肝干/前體細(xì)胞中的功能仍知之甚少。 本研究將從人肝細(xì)胞癌標(biāo)本和體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系入手,結(jié)合肝前體細(xì)胞標(biāo)志物OV6,一方面鑒定、分選出這樣一個(gè)具有前體細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群,并研究其細(xì)胞特性；另一方而,詳細(xì)闡述Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)這部分前體細(xì)胞功能的調(diào)節(jié),

10、尤其是對(duì)其自我更新能力和其它干/前體細(xì)胞特性的調(diào)節(jié)作用。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、用免疫組織化學(xué)的方法檢測OV6+肝前體細(xì)胞在正常肝臟、肝硬化、肝細(xì)胞癌中的分布情況； 2、用流式細(xì)胞儀檢測在體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系中OV6+肝癌細(xì)胞的比例； 3、使用MACS的方法從肝癌細(xì)胞系中分選出這部分OV6+肝癌細(xì)胞,并用RT-PCR的方法分析這部分OV6+肝癌細(xì)胞的特性； 4、觀察這部分OV6+肝癌細(xì)胞成瘤性；

11、 5、流式細(xì)胞儀檢測Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活(BIO刺激)對(duì)OV6+肝癌細(xì)胞自我更新能力的影響； 6、構(gòu)建干擾β-catenin慢病毒所需質(zhì)粒,包裝、純化慢病毒； 7、流式細(xì)胞儀檢測通過干擾β-catenin慢病毒降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性對(duì)OV6+肝癌細(xì)胞自我更新能力的影響； 8、檢測OV6+肝癌細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥物的耐受性(克隆形成實(shí)驗(yàn)); 9、觀察通過干擾β-caten

12、in慢病毒降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性對(duì)OV6+肝癌細(xì)胞藥物耐受性的影響。 結(jié)果： 1、在正常肝臟、肝硬化、肝細(xì)胞癌標(biāo)本中均發(fā)現(xiàn)OV6+肝前體細(xì)胞的存在； 2、在體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系中也存在OV6+肝癌細(xì)胞,其比例為0.2％到3％； 3、OV6+肝癌細(xì)胞具有干/前體細(xì)胞特性,在NOD/SCID小鼠體內(nèi)具有更高的成瘤性； 4、Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活能顯著提高這部分OV

13、6+肝癌細(xì)胞的比例,并促進(jìn)其自我更新；干擾β-catenin的慢病毒能降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性并降低了其自我更新的能力； 5、OV6+肝癌細(xì)胞對(duì)常規(guī)化療藥物具有更高的耐受性； 6、干擾β-catenin的慢病毒能降低Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性并提高這部分OV6+肝癌細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性； 結(jié)論： 本研究從人肝細(xì)胞癌標(biāo)本和體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系兩個(gè)方面,結(jié)合肝前體細(xì)胞標(biāo)志物OV6,