Wnt信號(hào)通路在肝星狀細(xì)胞活化中的作用觀察.pdf

1、背景/目的：各種病因所引起的慢性肝病絕大多數(shù)都有肝纖維化(hepati.fibrosis，HF)，其中25％～40％最終發(fā)展為肝硬化甚至肝癌，是一類世界性的嚴(yán)重危害人們健康的主要疾病。目前的研究證實(shí)，肝星狀細(xì)胞(hepati.stellat.cells，HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。各種因素通過(guò)不同方式和途徑作用于肝臟中的HSC，導(dǎo)致其生物學(xué)及功能變化，引起肝纖維化。研究這群細(xì)胞復(fù)雜的病理生理機(jī)制將是抗纖維化治療發(fā)展的關(guān)鍵。<

2、br>　　 Wnt信號(hào)通路是近年來(lái)在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和腫瘤研究中的一大熱點(diǎn)，參與調(diào)控細(xì)胞的分化、癌變、凋亡及機(jī)體免疫、應(yīng)激等生理病理過(guò)程。最近有研究表明Wnt信號(hào)通路與HSC的活化及肝纖維化的發(fā)生相關(guān)，但有關(guān)Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子在HSC活化中的作用尚無(wú)全面深入的研究。
　　 本課題首先利用基因芯片技術(shù)觀察Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子在HSC活化前后表達(dá)水平的變化，并用實(shí)時(shí)聚合酶反應(yīng)(rea.tim.PCR.RT-PCR)驗(yàn)證

3、部分表達(dá)變化基因；進(jìn)而觀察外源性小鼠Wnt5a(recombinan.Mous.Wnt5a，rmWnt5a)蛋白對(duì)HSC-T6增殖及I型膠原合成的影響；以期探討Wnt信號(hào)通路在肝纖維化發(fā)生中的作用，進(jìn)一步揭示肝纖維化的發(fā)生機(jī)制，為肝纖維化的防治提供新的可能途徑及干預(yù)靶點(diǎn)。
　　 方法：(1).利用膠原酶/鏈蛋白酶灌注Nycodenz梯密度離心分離大鼠HSC，于體外培養(yǎng)。(2).利用Affymetrix基因芯片觀察在HSC活化前后

4、基因譜表達(dá)水平的變化，結(jié)果中篩選出Wnt信號(hào)通路相關(guān)分子，以RT-PCR驗(yàn)證部分表達(dá)變化的基因。(3).體外培養(yǎng)HSC-T6細(xì)胞，加入rmWnt5a蛋白，用CCK-8法檢測(cè)其對(duì)HSC-T6的影響。(4).用ELISA法觀察rmWnt5a蛋白對(duì)HSC-T6合成I型膠原的影響。
　　 結(jié)果：(1).基因芯片結(jié)果顯示，活化的HSC與新鮮分離的靜止的HSC比較，表達(dá)上調(diào)的Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因共13條(Wisp2、Wnt4、Fzd2、P

5、LC、PKC、TGF-β1、Wisp1、TLE3、Ccnd2、Ccnd1、DKK3、Wifl、RhoA)。經(jīng)RT-PCR驗(yàn)證了其中2條(Wnt4、Fzd2)，結(jié)果與芯片檢測(cè)結(jié)果一致。(2).CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，濃度在0.2μg/mL～0.8μg/mL之間的rmWnt5a具有促HSC-T6增殖作用。當(dāng)rmWnt5a濃度在0.2μg/mL～0.4μg/mL時(shí)，隨著其濃度增長(zhǎng)，對(duì)HSC-T6具有顯著的濃度依賴性促細(xì)胞增殖作用(p<0.05

6、)。當(dāng)rmWnt5a濃度在0.4μg/mL-0.8μg/mL時(shí)，僅有輕度濃度依賴性促細(xì)胞增殖作用的趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(p>0.05)。(3).ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSC-T6培養(yǎng)細(xì)胞上清液中I型膠原含量隨著rmWnt5a濃度增加而逐漸增加。rmWnt5.0.2μg/ml組，0.4μg/ml組、0.8μg/ml組與對(duì)照組相比，I型膠原含量均有顯著性差異(p<0.05)。
　　 結(jié)論：(1).Wnt信號(hào)通路參與了HSC的活化