大鼠肝星狀細(xì)胞活化過(guò)程中Ras-ERK信號(hào)通路及miR-221-222表達(dá)的變化.pdf

1、【背景】
　　肝纖維化是肝炎病毒、酒精、藥物、自身免疫等多種原因引起的長(zhǎng)期慢性肝損害所致的損傷修復(fù)反應(yīng)，病理表現(xiàn)為肝細(xì)胞的損傷、變性壞死、炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)異常增生與沉積，是慢性肝炎向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段。目前認(rèn)為抗肝纖維化治療可減慢或部分逆轉(zhuǎn)肝硬化進(jìn)展。肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)，miRNA已被證實(shí)廣泛參與肝臟疾病，探索肝星狀細(xì)胞活化過(guò)程中的重要信號(hào)通路及相關(guān)miRNA的具體作用機(jī)制，尋找抑制甚至逆轉(zhuǎn)肝星狀細(xì)胞活化狀態(tài)的

2、可能途徑，為臨床干預(yù)治療肝纖維化提供理論依據(jù)。
　　【目的】
　　觀察HB-EGF激活HSC過(guò)程中Ras/ERK信號(hào)通路的變化及對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物的影響；并檢測(cè) miR-221/222表達(dá)的變化，探討 miR-221/222在 HSC活化過(guò)程中的作用。
　　【方法】
　　用含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HSC-T6，以2×105個(gè)/ml的密度接種于6孔板，24h后換含2%FBS的高糖DMEM同步化

3、24h后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)：1.以含不同濃度HB-EGF（20、40、80ng/ml）、2%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)HSC-T624、48h后，采用QRT-PCR法檢測(cè)不同濃度不同時(shí)間HB-EGF干預(yù)對(duì)HSC-T6 MMP-2、TIMP-1 mRNA表達(dá)的影響；采用QRT-PCR法檢測(cè)EGFR mRNA表達(dá)的變化，確定HB-EGF刺激HSC-T6 Ras/ERK通路（ERK1、ERK2、P38MAPK）活化的最佳濃度40ng/ml、最佳時(shí)間4

4、8h，并檢測(cè)其活化情況；2.以含HB-EGF（40ng/ml）的2%FBS的高糖DMEM、ERK特異性抑制劑PD98059（50μmol/L）+HB-EGF（40ng/ml）共處理HSC-T6，采用qRT-PCR法檢測(cè)miR-221/222表達(dá)水平，觀察ERK通路對(duì)miR-221/222表達(dá)的影響。
　　【結(jié)果】
　　1、QRT-PCR法檢測(cè)不同濃度HB-EGF（20、40、80ng/ml）、不同時(shí)間（24h，48h）對(duì)HS

5、C-T6細(xì)胞中MMP-2、TIMP-1 mRNA的表達(dá)，其中MMP-2隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)增加，TIMP-1隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)遞減，但與空白對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性。
　　2、QRT-PCR法檢測(cè)不同濃度HB-EGF（20、40、80ng/ml）、不同時(shí)間（24h，48h）對(duì)HSC-T6細(xì)胞中EGFR mRNA的影響，其中40ng/ml培養(yǎng)濃度組培養(yǎng)48h后EGFR mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組明顯上調(diào)（p<0.05）。
　　3

6、、以HB-EGF40ng/ml培養(yǎng)HSC-T648h，QRT-PCR法檢測(cè)HSC-T6細(xì)胞中Ras/ERK信號(hào)通路中ERK1、ERK2、P38MAPK mRNA的表達(dá)，ERK1 mRNA表達(dá)較空白對(duì)照組明顯上調(diào)（p<0.05），ERK2、P38MAPK變化無(wú)顯著性差異；Western blot法檢測(cè)ERK總蛋白的表達(dá)各組間無(wú)顯著性差異。
　　4、QRT-PCR法檢測(cè)HB-EGF（40ng/ml）、PD98059（50μmol/L）

7、+HB-EGF（40ng/ml）組及空白對(duì)照組miR-221、miR-222的表達(dá)，HB-EGF可促進(jìn)miR-221、miR-222的表達(dá)，PD98059+HB-EGF共同處理后，HSC-T6表達(dá)miR-221、miR-222下降（各組間p＜0.01）。
　　【結(jié)論】
　　1、 HB-EGF對(duì)HSC-T6的MMP-2，TIMP-1表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　2、 HB-EGF通過(guò)促進(jìn)HSC-T6表達(dá)EGFR、ERK1，有效激