Gremlin過表達(dá)增強(qiáng)大鼠肝星狀細(xì)胞(HSC-T6)的活化.pdf

1、目的:克隆大鼠gremlin基因,研究gremlin高表達(dá)對(duì)體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞生長(zhǎng)和活化的影響。本研究的目的是基于gremlin對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞活化影響的研究,初步了解認(rèn)識(shí)gremlin在肝纖維化病變過程中的可能作用機(jī)制,為肝纖維化分子發(fā)病機(jī)制的研究提供一定的研究基礎(chǔ)。
　　方法:(1)Nest-RT-PCR克隆大鼠gremlin基因編碼區(qū),將其克隆入真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+),構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒 pcDNA3.1(+

2、)/rgremlin。用pcDNA3.1(+)/rgremlin轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞,獲得穩(wěn)定高表達(dá) gremlin的細(xì)胞株。(2)MTT法檢測(cè)高表達(dá)gremlin對(duì)HSC-T6細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高表達(dá)gremlin對(duì)細(xì)胞周期的影響;細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)gremlin和α-SMA表達(dá);Western blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)α-SMA和膠原蛋白含量。(3)RT-PCR、Western blotting和熒光素酶報(bào)告

3、分析法檢測(cè)纖維化相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。
　　結(jié)果:(1)成功克隆大鼠gremlin基因編碼區(qū),構(gòu)建了gremlin真核表達(dá)質(zhì)粒,并獲得高表達(dá)gremlin的HSC-T6細(xì)胞株(19＃)。(2)MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照細(xì)胞相比較,高表達(dá)gremlin能抑制HSC-T6細(xì)胞的生長(zhǎng);Western blotting分析結(jié)果顯示,高表達(dá)gremlin能增強(qiáng)HSC-T6細(xì)胞的活化。(3)Western blotting檢測(cè)結(jié)果表明

4、,高表達(dá) gremlin可增強(qiáng)TGF-β及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白p-smad2/3的表達(dá),同時(shí)抑制smad7的表達(dá);RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果表明,高表達(dá)gremlin降低細(xì)胞內(nèi)BMP7信號(hào)分子的mRNA水平;熒光素酶報(bào)告分析和RT-PCR的結(jié)果顯示:高表達(dá)gremlin抑制星狀細(xì)胞內(nèi) NF-κB表達(dá),另外還發(fā)現(xiàn),高表達(dá)gremlin后,HSC-T6細(xì)胞內(nèi)Notch1和Notch2的mRNA和蛋白質(zhì)水平均出現(xiàn)明顯下調(diào)。
　　結(jié)論:在gre