巨噬細胞接觸對肝星狀細胞活化的研究.pdf

1、目的:
　　 通過大鼠肝星狀細胞與大鼠巨噬細胞間直接接觸與非接觸共培養(yǎng)，觀察細胞間連接對大鼠肝星狀細胞活化的影響。
　　 方法:
　　 1.分組:采用S-D大鼠，用原位膠原酶、蛋白酶序貫灌注法分散細胞，再采用密度梯度離心法分離得到肝星狀細胞(hepaticstellatecell，HSC)。用transwell培養(yǎng)系統(tǒng)實現(xiàn)非接觸共培養(yǎng)。分組:A組:將大鼠肝星狀細胞以0.5×105個/ml，1ml接種于transw

2、ell培養(yǎng)系統(tǒng)的小室，將大鼠巨噬細胞以3.0×105個/ml，2ml接種于transwell培養(yǎng)系統(tǒng)的大室;B組:將大鼠肝星狀細胞和大鼠巨噬細胞按A組的細胞數(shù)量比混勻后，分別于小室加1ml，于大室加2ml;C組:將巨噬細胞以3.0×105個/ml，2ml接種于transwell六孔板的大室中。D組:將大鼠肝星狀細胞以0.5×105個/ml，2ml接種于transwell培養(yǎng)系統(tǒng)的大室，將大鼠巨噬細胞以3.0×105個/ml，1ml接種于

3、transwell培養(yǎng)系統(tǒng)的小室;E組:將大鼠肝星狀細胞和大鼠巨噬細胞按C組的細胞數(shù)量比混勻后，分別于小室加1ml，于大室加2ml;F組:將大鼠肝星狀細胞以0.5×105個/ml，2ml接種于transwell培養(yǎng)系統(tǒng)的大室。
　　 2.觀察指標:①HSC的α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA），用免疫細胞化學(xué)法。②細胞上清液中的Ⅰ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、血小板衍化生長因子(PDGF)的分泌量，用酶聯(lián)免疫吸附法(E

4、LISA)。
　　 ③細胞的增殖情況，用四甲基偶氮唑藍(MTT)法。
　　 3.統(tǒng)計方法:多個樣本均數(shù)的比較采用one-wayANOVA，多個樣本均數(shù)的兩兩比較采用LSD法檢驗，P＜0.05為在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異。
　　 結(jié)果:
　　 1.A、B、D、E、F組肝星狀細胞的α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)陽性表達。
　　 2.細胞上清液中的Ⅰ型膠原:A組:36.364±1.892ng/ml;B組:2

5、3.502±1.474ng/ml;C組:10.293±1.724ng/ml;D組:42.331±2.701ng/ml;E組:31.337±0.792ng/ml;F組:35.544±0.907ng/ml;B組含量小于A組，E組含量小于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，即巨噬細胞和星狀細胞直接接觸的共同培養(yǎng)組Ⅰ型膠原含量比巨噬細胞同星狀細胞非接觸共培養(yǎng)組明顯少;
　　 細胞上清液中的轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1):A組:3

6、01.115±15.448pg/ml;B組:406.182±19.224pg/ml;C組:265.140±10.521pg/ml;D組:383.555±9.246pg/ml;E組:435.356±5.842pg/ml;F組:279.726±8.517pg/ml;細胞上清液中的血小板衍化生長因子(PDGF):A組:67.916±4.830pg/ml;B組:77.838±4.014pg/ml;C組:60.034±5.677pg/ml;D組:

7、87.678±3.643pg/ml;E組:95.189±1.672pg/ml;F組:65.646±2.032pg/ml;B組中2種細胞因子含量均大于A組，E組中2種細胞因子含量均大于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，即巨噬細胞和星狀細胞直接接觸的共同培養(yǎng)組PDGF和TGF-β1的量比巨噬細胞同星狀細胞非接觸共培養(yǎng)組明顯升高;
　　 3.細胞于transwell培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)48h后行MTT檢測所得的OD值:A組:0.63±0

8、.02;B組:0.34±0.02;C組:0.38±0.01;D組:0.72±0.08;E組:0.30±0.01;F組:0.48±0.05;B組小于A組，E組小于D組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，即在起始細胞數(shù)量相同條件下，培養(yǎng)48h后巨噬細胞和星狀細胞直接接觸的共同培養(yǎng)組的細胞數(shù)量比巨噬細胞同星狀細胞非接觸共培養(yǎng)組少;
　　 結(jié)論:
　　 1.巨噬細胞與肝星狀細胞之間的直接接觸可使PDGF和TGF-β1的分泌量明顯