體外高表達TL1A的巨噬細胞對肝星狀細胞活化、增殖的影響.pdf

1、肝星狀細胞(hepatic stellate cells,HSCs)的活化和增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，活化的HSCs是合成細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的主要細胞，HSCs的活化與增殖可大量合成ECM，在肝組織內(nèi)異常沉積，從而引起肝纖維化。巨噬細胞作為機體重要的固有免疫細胞，在HSCs活化、增殖中起到調(diào)控作用。在肝纖維化進展過程中，寄居在肝臟中的巨噬細胞(macrophages, MΦ)即枯否細胞(K

2、uffer cells,KCs)通過分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(interleukin,IL-1β)和血小板衍生生長因子-BB(platelet-derived growth factor, PDGF-BB)等促炎、促纖維化因子造成肝細胞損傷，促進HSCs的活化與增殖；而被激活的HSCs和損傷的肝細胞分泌CC族趨化因子2(CC chemokine ligan2,CCL2)

3、為主的趨化因子進一步募集血液中的單核巨噬細胞加重肝損傷和促進肝纖維化發(fā)生。因此，研究巨噬細胞的功能及其對HSCs的影響對進一步了解肝纖維化發(fā)生機制非常重要。
　　腫瘤壞死因子樣配體1A(tumor necrosis factor-like ligand1 aberrance,TL1A)是腫瘤壞死因子超家族成員15(tumor necrosis factor superfamily member15,TNFSF15)基因的蛋白產(chǎn)物，

4、主要在內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、漿細胞、單個核細胞和樹突細胞表達。我們課題組前期研究證明，TL1A可促進慢性實驗性結腸炎小鼠腸纖維化的發(fā)生以及促進腸組織中巨噬細胞的活化與募集。目前為止對于TL1A在肝臟疾病中的研究比較少見，在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清和肝組織巨噬細胞中TL1A表達升高，且在熊去氧膽酸治療后血清TL1A水平下降。由此可見TL1A的高表達有可能促進肝纖維化發(fā)生。TL1A作為TNF的唯一配體，可通過與其受體死亡受體3(death

5、receptor3,DR3)結合，誘導巨噬細胞的活化。既往有大量體外研究證實巨噬細胞可促進HSCs的活化、增殖，但尚無研究TL1A高表達的巨噬細胞對 HSCs活化增殖的影響。為此，本實驗在于探索體外高表達TL1A的巨噬細胞對HSCs活化、增殖的影響，有可能為肝纖維化的治療提供新靶點。
　　目的：探討體外高表達TL1A的巨噬細胞對肝星狀細胞的活化、增殖的影響。
　　方法：①采用real-time Q-PCR方法進行FMS-TL

6、1A-GFP transgenic基因型小鼠的鑒定與篩選；②分離、分化并活化C57BL/6野生型(wild type, WT)與轉基因(transgenic,Tg)小鼠骨髓來源的巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)和腹腔巨噬細胞(peritoneal macrophages,PMs)；采用原位循環(huán)灌流和密度梯度離心技術分離WT小鼠原代HSCs；③實驗分組：MΦ部分：BMMs與PMs分別分為

7、Control/WT組、LPS+IFN-γ/WT組、Control/Tg組、LPS+IFN-γ/Tg組；HSCs部分：收取 LPS+IFN-γ/WT組及 LPS+IFN-γ/Tg組培養(yǎng)液上清，為條件培養(yǎng)基(conditional medium,CM)；將CM分別干預小鼠原代HSCs，實驗分組如下：Control組，以含10％胎牛血清的 DMEM細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠原代HSCs；LPS+IFN-γ+M-CSF組，以含10%胎牛血清的DMEM

8、細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠原代HSCs，并加入LPS、IFN-γ和M-CSF（PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs不加M-CSF）；CM WT組，用含10%胎牛血清的LPS+IFN-γ/WT組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠原代 HSCs；CM Tg組，用含10%胎牛血清的LPS+IFN-γ/Tg組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠原代HSCs；④熒光顯微鏡觀察剛分離的原代HSCs；免疫熒光法檢測MΦF4/80與TL1A共表達情況以及HSCs標志物結蛋白(desmin)與α-平滑肌

9、肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達情況；CCK-8法檢測MΦCM促HSCs增殖的最適濃度以及CCK-8法及BrdU法檢測HSCs增殖情況；real-time Q-PCR方法檢測MΦTL1A與DR3以及HSCs2、4、6天的α-SMA mRNA表達情況；Western blot方法檢測MΦTL1A與DR3蛋白表達情況；酶聯(lián)吸附反應試驗(enzyme-linked immune sorbent assa

10、y, ELISA)測定各組MΦ培養(yǎng)上清液中IL-1β和PDGF-BB的含量。
　　結果：①根據(jù)基因FMS-TL1A-GFP序列測定小鼠DNA，Tg小鼠目的基因測定成像在191 bp位置，而WT小鼠基因測定成像，在191 bp位置未檢測到目的基因，據(jù)此篩選鑒定Tg小鼠。②成功分離出BMMs及PMs，每只小鼠細胞得率分別為90×106～110×106、10×106~12×106，細胞存活率大于95%。③免疫熒光細胞化學結果顯示MΦ胞膜

11、有F4/80表達，且Tg組TL1A蛋白表達水平較WT組明顯升高(BMMs:0.029±0.002 vs0.011±0.002,P<0.01;PMs:0.025±0.002 vs0.010±0.002,P<0.01)；對于BMMs，real-time Q-PCR方法檢測TL1A mRNA在各組表達結果顯示：巨噬細胞加入LPS、IFN-γ刺激后TL1A mRNA表達量較相應對照組明顯升高，P<0.01，且與LPS+IFN-γ/WT組相比，L

12、PS+IFN-γ/Tg組升高更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義,P<0.01；Western blot方法檢測TL1A蛋白在各組表達結果顯示：LPS+IFN-γ/WT組較Control/WT組TL1A蛋白表達無明顯差異，P>0.05，Tg小鼠巨噬細胞TL1A蛋白表達量明顯高于WT小鼠巨噬細胞，P<0.01，且與Control/Tg組相比，LPS+IFN-γ/Tg組升高更為顯著，P<0.01；對于PMs的檢測結果與上述趨勢一致，證明成功提取出TL

13、1A高表達的MΦ。④BMMs和PMs的DR3 mRNA和蛋白表達水平各組之間無明顯差異，P>0.05。⑤采用肝臟原位灌注法，以Percoll為介質(zhì)密度梯度離心，分離小鼠原代HSCs。細胞得率為0.8×106～1.0×106/只，存活率和純度均大于90%。在倒置顯微鏡下觀察剛分離出的HSCs呈圓形，胞漿中含有較多脂滴，在波長328nm的熒光顯微鏡下觀察，HSCs自發(fā)藍色熒光；24h HSCs貼壁后進行免疫熒光法可檢測到desmin。⑥CC

14、K-8法結果顯示應用60%BMMs和PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs24h對其促進增殖效果最為顯著。⑦CCK-8法檢測HSCs增殖速率結果顯示：應用BMMs來源的CM培養(yǎng)HSCs，LPS+IFN-γ+M-CSF組(100.54%±8.11%)與Control組(100.82%±8.48%)無明顯差異(P>0.05)，而與Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比，應用CM培養(yǎng)的HSCs增殖速率顯著升高，且CM Tg組(246.2

15、1%±8.34%)明顯高于CM WT組(203.24%±10.50%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；應用PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs，檢測結果與上述趨勢一致。⑧BrdU法檢測 HSCs DNA合成速率結果顯示：應用BMMs來源的CM培養(yǎng)HSCs，LPS+IFN-γ+M-CSF組(102.01%±8.04%)與Control組(100.00%±8.62%)無明顯差異(P>0.05)，而與 Control組及LPS+IFN-γ+M-

16、CSF組相比，應用CM培養(yǎng)的HSCs DNA合成速率顯著升高，且CM Tg組(182.24%±8.68%)明顯高于CM WT組(150.75%±9.12%)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；應用PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs，檢測結果與上述趨勢一致。⑨應用BMMs來源的CM培養(yǎng)HSCs，免疫熒光法分別檢測2、4、6天α-SMA蛋白表達量，結果顯示：第2天和第6天時各組間無明顯差異，P>0.05；第4天時Control組與LPS+IFN

17、-γ+M-CSF組無明顯差異(P>0.05)，與 Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比，應用CM干預的HSCsα-SMA表達水平顯著升高，且CM/Tg組明顯高于CM/WT組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs的檢測結果與上述趨勢一致。⑩應用BMMs來源的CM培養(yǎng) HSCs，real-time Q-PCR法分別檢測2、4、6天α-SMA mRNA表達含量，結果顯示：第2天時各組無明顯差異，P

18、>0.05；第4天時Control組與LPS+IFN-γ+M-CSF組無明顯差異(P>0.05)，與Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比，CM組α-SMA表達水平顯著升高(P<0.01)，且CM/Tg組明顯高于CM/WT組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；第6天時Control組與LPS+IFN-γ+M-CSF組無明顯差異(P>0.05)，與Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比，CM組α-SMA表

19、達水平顯著升高，且CM/Tg組明顯高于CM/WT組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；PMs來源的CM培養(yǎng) HSCs的檢測結果與上述趨勢一致。?ELISA檢測結果顯示：對于BMMs的培養(yǎng)上清液，加入LPS和IFN-γ刺激后的巨噬細胞與相應對照組相比，IL-1β和PDGF-BB表達水平顯著升高(P<0.01)，且LPS+IFN-γ/Tg組比LPS+IFN-γ/WT組升高更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而對于PMs的培養(yǎng)上清液