體外高表達(dá)TL1A的巨噬細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞活化、增殖的影響.pdf

1、肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)的活化和增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，活化的HSCs是合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的主要細(xì)胞，HSCs的活化與增殖可大量合成ECM，在肝組織內(nèi)異常沉積，從而引起肝纖維化。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞，在HSCs活化、增殖中起到調(diào)控作用。在肝纖維化進(jìn)展過程中，寄居在肝臟中的巨噬細(xì)胞(macrophages, MΦ)即枯否細(xì)胞(K

2、uffer cells,KCs)通過分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(interleukin,IL-1β)和血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB(platelet-derived growth factor, PDGF-BB)等促炎、促纖維化因子造成肝細(xì)胞損傷，促進(jìn)HSCs的活化與增殖；而被激活的HSCs和損傷的肝細(xì)胞分泌CC族趨化因子2(CC chemokine ligan2,CCL2)

3、為主的趨化因子進(jìn)一步募集血液中的單核巨噬細(xì)胞加重肝損傷和促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。因此，研究巨噬細(xì)胞的功能及其對(duì)HSCs的影響對(duì)進(jìn)一步了解肝纖維化發(fā)生機(jī)制非常重要。
　　腫瘤壞死因子樣配體1A(tumor necrosis factor-like ligand1 aberrance,TL1A)是腫瘤壞死因子超家族成員15(tumor necrosis factor superfamily member15,TNFSF15)基因的蛋白產(chǎn)物，

4、主要在內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞和樹突細(xì)胞表達(dá)。我們課題組前期研究證明，TL1A可促進(jìn)慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸纖維化的發(fā)生以及促進(jìn)腸組織中巨噬細(xì)胞的活化與募集。目前為止對(duì)于TL1A在肝臟疾病中的研究比較少見，在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清和肝組織巨噬細(xì)胞中TL1A表達(dá)升高，且在熊去氧膽酸治療后血清TL1A水平下降。由此可見TL1A的高表達(dá)有可能促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。TL1A作為TNF的唯一配體，可通過與其受體死亡受體3(death

5、receptor3,DR3)結(jié)合，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化。既往有大量體外研究證實(shí)巨噬細(xì)胞可促進(jìn)HSCs的活化、增殖，但尚無研究TL1A高表達(dá)的巨噬細(xì)胞對(duì) HSCs活化增殖的影響。為此，本實(shí)驗(yàn)在于探索體外高表達(dá)TL1A的巨噬細(xì)胞對(duì)HSCs活化、增殖的影響，有可能為肝纖維化的治療提供新靶點(diǎn)。
　　目的：探討體外高表達(dá)TL1A的巨噬細(xì)胞對(duì)肝星狀細(xì)胞的活化、增殖的影響。
　　方法：①采用real-time Q-PCR方法進(jìn)行FMS-TL

6、1A-GFP transgenic基因型小鼠的鑒定與篩選；②分離、分化并活化C57BL/6野生型(wild type, WT)與轉(zhuǎn)基因(transgenic,Tg)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)和腹腔巨噬細(xì)胞(peritoneal macrophages,PMs)；采用原位循環(huán)灌流和密度梯度離心技術(shù)分離WT小鼠原代HSCs；③實(shí)驗(yàn)分組：MΦ部分：BMMs與PMs分別分為

7、Control/WT組、LPS+IFN-γ/WT組、Control/Tg組、LPS+IFN-γ/Tg組；HSCs部分：收取 LPS+IFN-γ/WT組及 LPS+IFN-γ/Tg組培養(yǎng)液上清，為條件培養(yǎng)基(conditional medium,CM)；將CM分別干預(yù)小鼠原代HSCs，實(shí)驗(yàn)分組如下：Control組，以含10％胎牛血清的 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠原代HSCs；LPS+IFN-γ+M-CSF組，以含10%胎牛血清的DMEM

8、細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠原代HSCs，并加入LPS、IFN-γ和M-CSF（PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs不加M-CSF）；CM WT組，用含10%胎牛血清的LPS+IFN-γ/WT組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠原代 HSCs；CM Tg組，用含10%胎牛血清的LPS+IFN-γ/Tg組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠原代HSCs；④熒光顯微鏡觀察剛分離的原代HSCs；免疫熒光法檢測(cè)MΦF4/80與TL1A共表達(dá)情況以及HSCs標(biāo)志物結(jié)蛋白(desmin)與α-平滑肌

9、肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達(dá)情況；CCK-8法檢測(cè)MΦCM促HSCs增殖的最適濃度以及CCK-8法及BrdU法檢測(cè)HSCs增殖情況；real-time Q-PCR方法檢測(cè)MΦTL1A與DR3以及HSCs2、4、6天的α-SMA mRNA表達(dá)情況；Western blot方法檢測(cè)MΦTL1A與DR3蛋白表達(dá)情況；酶聯(lián)吸附反應(yīng)試驗(yàn)(enzyme-linked immune sorbent assa

10、y, ELISA)測(cè)定各組MΦ培養(yǎng)上清液中IL-1β和PDGF-BB的含量。
　　結(jié)果：①根據(jù)基因FMS-TL1A-GFP序列測(cè)定小鼠DNA，Tg小鼠目的基因測(cè)定成像在191 bp位置，而WT小鼠基因測(cè)定成像，在191 bp位置未檢測(cè)到目的基因，據(jù)此篩選鑒定Tg小鼠。②成功分離出BMMs及PMs，每只小鼠細(xì)胞得率分別為90×106～110×106、10×106~12×106，細(xì)胞存活率大于95%。③免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示MΦ胞膜

11、有F4/80表達(dá)，且Tg組TL1A蛋白表達(dá)水平較WT組明顯升高(BMMs:0.029±0.002 vs0.011±0.002,P<0.01;PMs:0.025±0.002 vs0.010±0.002,P<0.01)；對(duì)于BMMs，real-time Q-PCR方法檢測(cè)TL1A mRNA在各組表達(dá)結(jié)果顯示：巨噬細(xì)胞加入LPS、IFN-γ刺激后TL1A mRNA表達(dá)量較相應(yīng)對(duì)照組明顯升高，P<0.01，且與LPS+IFN-γ/WT組相比，L

12、PS+IFN-γ/Tg組升高更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P<0.01；Western blot方法檢測(cè)TL1A蛋白在各組表達(dá)結(jié)果顯示：LPS+IFN-γ/WT組較Control/WT組TL1A蛋白表達(dá)無明顯差異，P>0.05，Tg小鼠巨噬細(xì)胞TL1A蛋白表達(dá)量明顯高于WT小鼠巨噬細(xì)胞，P<0.01，且與Control/Tg組相比，LPS+IFN-γ/Tg組升高更為顯著，P<0.01；對(duì)于PMs的檢測(cè)結(jié)果與上述趨勢(shì)一致，證明成功提取出TL

13、1A高表達(dá)的MΦ。④BMMs和PMs的DR3 mRNA和蛋白表達(dá)水平各組之間無明顯差異，P>0.05。⑤采用肝臟原位灌注法，以Percoll為介質(zhì)密度梯度離心，分離小鼠原代HSCs。細(xì)胞得率為0.8×106～1.0×106/只，存活率和純度均大于90%。在倒置顯微鏡下觀察剛分離出的HSCs呈圓形，胞漿中含有較多脂滴，在波長(zhǎng)328nm的熒光顯微鏡下觀察，HSCs自發(fā)藍(lán)色熒光；24h HSCs貼壁后進(jìn)行免疫熒光法可檢測(cè)到desmin。⑥CC

14、K-8法結(jié)果顯示應(yīng)用60%BMMs和PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs24h對(duì)其促進(jìn)增殖效果最為顯著。⑦CCK-8法檢測(cè)HSCs增殖速率結(jié)果顯示：應(yīng)用BMMs來源的CM培養(yǎng)HSCs，LPS+IFN-γ+M-CSF組(100.54%±8.11%)與Control組(100.82%±8.48%)無明顯差異(P>0.05)，而與Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比，應(yīng)用CM培養(yǎng)的HSCs增殖速率顯著升高，且CM Tg組(246.2

15、1%±8.34%)明顯高于CM WT組(203.24%±10.50%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；應(yīng)用PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs，檢測(cè)結(jié)果與上述趨勢(shì)一致。⑧BrdU法檢測(cè) HSCs DNA合成速率結(jié)果顯示：應(yīng)用BMMs來源的CM培養(yǎng)HSCs，LPS+IFN-γ+M-CSF組(102.01%±8.04%)與Control組(100.00%±8.62%)無明顯差異(P>0.05)，而與 Control組及LPS+IFN-γ+M-

16、CSF組相比，應(yīng)用CM培養(yǎng)的HSCs DNA合成速率顯著升高，且CM Tg組(182.24%±8.68%)明顯高于CM WT組(150.75%±9.12%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；應(yīng)用PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs，檢測(cè)結(jié)果與上述趨勢(shì)一致。⑨應(yīng)用BMMs來源的CM培養(yǎng)HSCs，免疫熒光法分別檢測(cè)2、4、6天α-SMA蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示：第2天和第6天時(shí)各組間無明顯差異，P>0.05；第4天時(shí)Control組與LPS+IFN

17、-γ+M-CSF組無明顯差異(P>0.05)，與 Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比，應(yīng)用CM干預(yù)的HSCsα-SMA表達(dá)水平顯著升高，且CM/Tg組明顯高于CM/WT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs的檢測(cè)結(jié)果與上述趨勢(shì)一致。⑩應(yīng)用BMMs來源的CM培養(yǎng) HSCs，real-time Q-PCR法分別檢測(cè)2、4、6天α-SMA mRNA表達(dá)含量，結(jié)果顯示：第2天時(shí)各組無明顯差異，P

18、>0.05；第4天時(shí)Control組與LPS+IFN-γ+M-CSF組無明顯差異(P>0.05)，與Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比，CM組α-SMA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，且CM/Tg組明顯高于CM/WT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第6天時(shí)Control組與LPS+IFN-γ+M-CSF組無明顯差異(P>0.05)，與Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比，CM組α-SMA表

19、達(dá)水平顯著升高，且CM/Tg組明顯高于CM/WT組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；PMs來源的CM培養(yǎng) HSCs的檢測(cè)結(jié)果與上述趨勢(shì)一致。?ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)于BMMs的培養(yǎng)上清液，加入LPS和IFN-γ刺激后的巨噬細(xì)胞與相應(yīng)對(duì)照組相比，IL-1β和PDGF-BB表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，且LPS+IFN-γ/Tg組比LPS+IFN-γ/WT組升高更明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；而對(duì)于PMs的培養(yǎng)上清液