活化的肝星狀細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓來(lái)源抑制性細(xì)胞擴(kuò)增和遷移的機(jī)制研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第五大常見(jiàn)的惡性腫瘤，在腫瘤致死的病因中排名第三位。在全球，每年有超過(guò)50萬(wàn)人死于肝癌，且一半以上在中國(guó)。隨著科學(xué)研究的發(fā)展，科研人員發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)生發(fā)展不僅僅是病毒感染、環(huán)境因素、基因突變這些因素，腫瘤微環(huán)境對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有著重要作用。肝臟是一個(gè)具有“免疫特赦”的臟器，肝癌微環(huán)境中的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞及其細(xì)胞因子是肝癌的免疫逃逸，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素。

2、>　　肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSCs）是肝癌微環(huán)境中重要的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞?；罨男菭罴?xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)能力，能夠誘導(dǎo)免疫抑制細(xì)胞的產(chǎn)生，促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。髓系來(lái)源抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSCs)是具有免疫負(fù)調(diào)控作用的免疫抑制細(xì)胞，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。前期研究發(fā)現(xiàn)活化的星狀細(xì)胞能促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展，促進(jìn)肝癌中MDSCs的蓄積。然而在活化的HS

3、Cs誘導(dǎo)MDSCs在肝癌微環(huán)境中蓄積的機(jī)制并不清楚。本文能過(guò)以下三個(gè)部分研究進(jìn)行探討和闡述。
　　第一部分 髓系來(lái)源抑制性細(xì)胞及其亞群的分選
　　本章首先通過(guò)流式分選方法對(duì)比不同的流式抗體分選荷瘤小鼠骨髓中的MDSCs的可行性。我們單標(biāo)APC-CD11b或PE-Gr-1或雙標(biāo)APC-CD11b，PE-Gr-1，對(duì)比其分選后的細(xì)胞純度和細(xì)胞活力，發(fā)現(xiàn)三各方法分選得到的細(xì)胞90％以上為CD11b+Gr-1+的細(xì)胞，即MDSCs，

4、且其細(xì)胞活力都達(dá)95％以上。然而用CD11b單色標(biāo)記分選MDSCs既可以滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞純度和活力的要求，又重復(fù)性高，減少熒光素染料對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干擾，同時(shí)也節(jié)省資源。
　　為了進(jìn)一步研究MDSCs亞群，我們還建立不同的方法分選荷瘤小鼠脾臟中PMN-MDSCs和Mo-MDSCs。應(yīng)用流式和磁珠分選的方法都能得到高純度和高活力的PMN-MDSCs和Mo-MDSCs。而PMN-MDSCs在脾臟中比例較高，流式分選會(huì)更節(jié)省資源。而Mo-MD

5、SCs在脾臟中比例很少，則選用磁珠分選的方法可以更省時(shí)間。本部分研究提供了MDSCs及亞群的分選方法，為后續(xù)HSCs對(duì)MDSCs作用的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 活化的肝星狀細(xì)胞促進(jìn)髓系來(lái)源抑制性細(xì)胞擴(kuò)增的機(jī)制研究
　　在體外，HSCs條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞向MDSCs分化，促進(jìn)PMN-MDSCs和Mo-MDSCs的擴(kuò)增。用COX2抑制劑處理HSCs和EP4抑制劑抑制骨髓細(xì)胞的PGE2受體， HSCs細(xì)胞的上清不能誘

6、導(dǎo)MDSCs及PMN-MDSCs的擴(kuò)增，證明HSCs通過(guò)分泌PGE2/EP4誘導(dǎo)MDSCs及的擴(kuò)增。在體內(nèi)小鼠肝癌模型中，我們用COX2抑制劑處理的HSCs與肝癌細(xì)胞共移植，HSCs促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的能力減弱，HSCs誘導(dǎo)脾臟和腫瘤中的MDSCs及其亞群的能力均減弱。研究結(jié)果表明HSCs通過(guò)PGE2/EP4通路誘導(dǎo)MDSCs及其亞群的擴(kuò)增，為肝癌的免疫治療提供新的理論基礎(chǔ)。本研究首次探討了肝癌微環(huán)境中HSCs與MDSCs及亞群的關(guān)系。

7、>　　第三部分 活化的肝星狀細(xì)胞促進(jìn)髓系來(lái)源抑制性細(xì)胞遷移及其機(jī)制研究
　　本章通過(guò)用HSCs條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)荷瘤小鼠脾細(xì)胞遷移，證明了活化的肝星狀細(xì)胞對(duì)荷瘤小鼠脾臟細(xì)胞中MDSCs有顯著性的趨化作用，且HSCs條件培養(yǎng)基能顯著升高M(jìn)o-MDSCs的趨化能力。蛋白芯片分析HSCs條件培養(yǎng)基中趨化因子的表達(dá)情況，結(jié)果表明HSCs主要含有趨化因子CCL2，SDF-1，CXCL1，CXCL5。進(jìn)一步分選PMN-MDSCs和Mo-MDSCs

8、用PCR基因芯片分析其趨化因子及受體的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CCL2的受體CCR2在Mo-MDSCs的表達(dá)比PMN-MDSCs高了515.5倍，而CXCL1，CXCL5的受體CXCR2則主要表達(dá)在PMN-MDSCs，SDF-1受體CXCR4在PMN-MDSCs和Mo-MDSCs上都高表達(dá)。進(jìn)一步我們用分別這些趨化因子中和抗體和受體的拮抗劑處理HSCs條件培養(yǎng)基和MDSCs，結(jié)果表明只有SDF-1中和抗體和CXCR4拮抗劑能阻斷HSCs件培養(yǎng)