miR-214通過抑制HIF1AN的表達(dá)促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化和遷移.pdf

1、研究背景與目的：
　　 肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經(jīng)的病理改變。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellate cell，HSC)的活化是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，也是膠原蛋白沉積的關(guān)鍵因素。microRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，在轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。研究表明microRNA是慢性肝臟疾病進(jìn)展過程中的重要調(diào)節(jié)因子。已有大量國內(nèi)外文章報道m(xù)iR-214在多種細(xì)胞內(nèi)

2、發(fā)揮著重要生物學(xué)調(diào)節(jié)作用，包括細(xì)胞增殖、凋亡、分化、脂肪代謝等。既往芯片數(shù)據(jù)顯示miR-214在大鼠肝星狀細(xì)胞活化過程中顯著升高，本論文研究目的旨在研究miR-214在肝星狀細(xì)胞活化過程中的調(diào)節(jié)作用，為肝纖維化的早期干預(yù)提供新的思路。
　　 本研究通過應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)，對肝星狀細(xì)胞活化過程（靜息狀態(tài)—活化狀態(tài)）、DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織(S0-S4期)、乙肝（HBV）相關(guān)肝纖維化病人各期肝組織(F0-F4期)以

3、及TGF-β刺激前后的肝星狀細(xì)胞進(jìn)行miR-214表達(dá)水平檢測，證實miR-214在肝星狀細(xì)胞活化過程、DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型、HBV相關(guān)肝纖維化病人肝組織標(biāo)本以及TGF-β刺激后的肝星狀細(xì)胞中顯著升高，并與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。通過構(gòu)建miR-214過表達(dá)及knockdown慢病毒載體，研究miR-214對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和活化功能的影響，并探討可能的機(jī)制。研究共分三個部分:(1)肝星狀細(xì)胞活化過程（靜息狀態(tài)-活

4、化狀態(tài)）、DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織、乙型病毒肝炎(HBV)相關(guān)肝纖維化病人各期肝組織以及TGF-β刺激前后的肝星狀細(xì)胞進(jìn)行miR-214表達(dá)水平檢測;(2) miR-214慢病毒載體(過表達(dá)及knockdown)對肝星狀細(xì)胞增殖、遷移與活化功能的影響;(3) miR-214靶基因的驗證。
　　 一、miR-214與肝星狀細(xì)胞的活化密切相關(guān)
　　 目的:檢測miR-214在不同狀態(tài)肝星狀細(xì)胞以及各期肝纖維化組織

5、中的表達(dá)水平，了解miR-214與肝星狀細(xì)胞活化以及肝纖維化進(jìn)程的相關(guān)性。
　　 方法:分離培養(yǎng)原代肝星狀細(xì)胞，收集24例不同分期的肝纖維化病人肝穿標(biāo)本，并構(gòu)建DMN誘導(dǎo)的肝纖維化動物模型，通過實時定量PCR技術(shù)檢測肝星狀細(xì)胞活化過程（靜息狀態(tài)—活化狀態(tài)）、DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織(S0-S4期)、乙肝相關(guān)肝纖維化病人各期肝組織(F0-F4期)以及TGF-β刺激前后的肝星狀細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平。
　　

6、 結(jié)果:成功分離、鑒定、培養(yǎng)原代肝星狀細(xì)胞，根據(jù)形態(tài)學(xué)特征及活化標(biāo)志物的表達(dá)，將HSC2d作為靜息狀態(tài)HSC，14d作為完全活化狀態(tài)HSC;構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，根據(jù)肝組織病理結(jié)果，DMN給藥第一周作為肝纖維化S1期，給藥第二周作為肝纖維化S2期，給藥第三周作為肝纖維化S3期，給藥第四周作為肝纖維化S4期。抽提細(xì)胞、組織RNA，采用實時定量PCR方法證實:miR-214在肝星狀細(xì)胞活化過程、DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型、HBV相關(guān)肝纖維

7、化病人肝組織標(biāo)本以及TGF-β刺激后的肝星狀細(xì)胞中顯著升高，并與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。miR-214在HSC活化過程中表達(dá)顯著升高達(dá)26倍(P＜0.01);以S0期肝組織作為對照組，S1-S4期組織中miR-214水平分別為對照組1.8倍、2.2倍、4倍、7.8倍(P＜0.05);以F0期肝組織作為對照組，F(xiàn)1-F4期組織中miR-214水平分別為對照組5倍、9倍、6倍、7倍(P＜0.01);TGF-β刺激后miR-214表達(dá)明顯升

8、高達(dá)刺激前7倍(P＜0.05).
　　 二、miR-214促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的遷移與活化
　　 目的:研究miR-214在細(xì)胞分子水平對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、遷移和活化功能的影響。
　　 方法:構(gòu)建miR-214過表達(dá)及knockdown慢病毒載體，通過對病毒質(zhì)粒的包裝、擴(kuò)增與濃縮，最后形成有效的慢病毒顆粒;以不同MOI值(MOI取10到30)感染HSC-T6，應(yīng)用熒光顯微鏡及實時定量PCR技術(shù)評估其感染效率;應(yīng)用CC

9、K-8檢測細(xì)胞增殖，Transwell方法檢測細(xì)胞遷移，real-time PCR、Western Blot方法檢測肝星狀細(xì)胞活化標(biāo)志物TypeⅠ collagen與α-SMA mRNA與蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建miR-214過表達(dá)及knockdown慢病毒載體，MOI值=30時，慢病毒感染HSC-T6的效率達(dá)90％以上，real-time PCR檢測miR-214過表達(dá)慢病毒感染HSC-T6后miR-214的表達(dá)

10、量增加3倍(P＜0.01);與陰性病毒感染組(mock)相比，miR-214能顯著促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的遷移與活化，但是對細(xì)胞增殖無明顯影響。
　　 三、miR-214靶基因的驗證
　　 目的:探索miR-214在肝星狀細(xì)胞中發(fā)揮生物學(xué)作用的可能機(jī)制。
　　 方法:采用生物信息學(xué)技術(shù)篩選相關(guān)靶基因，通過熒光質(zhì)粒報告系統(tǒng)對靶基因HIF1AN進(jìn)行驗證;采用實時定量PCR、Western Blot檢測miR-214過表達(dá)及k

11、nockdown組、肝星狀細(xì)胞活化過程（靜息狀態(tài)-活化狀態(tài)）中、TGF-β刺激前后以及乙型病毒肝炎(HBV)相關(guān)肝纖維化病人各期肝組織中HIF1AN的表達(dá)。
　　 結(jié)果:熒光質(zhì)粒報告系統(tǒng)顯示:miR-214mimics可以顯著抑制攜有HIF1AN3'UTR的載體的熒光素酶活性達(dá)40％(P＜0.001);與陰性病毒感染組相比，miR-214過表達(dá)顯著降低HIF1AN mRNA和蛋白的表達(dá)量(P＜0.01)，miR-214 knoc

12、kdow顯著增加HIF1ANmRNA和蛋白的表達(dá)量(P＜0.05);與靜息狀態(tài)(2d)肝星狀細(xì)胞相比，HIF1AN在活化狀態(tài)(14d)肝星狀細(xì)胞中表達(dá)下降50％(P＜0.001);與TGF-β刺激前相比，TGF-β刺激后HIF1AN表達(dá)量下降35％(P＜0.01);與F0期病人肝組織相比，HIF1AN表達(dá)量與肝纖維化程度呈反比(P＜0.05)。
　　 四、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)由SPSS16.0軟

13、件統(tǒng)計包處理。多組間的比較用One-Way ANOVA方差分析。P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 一、miR-214在肝星狀細(xì)胞活化過程、DMN誘導(dǎo)大鼠肝纖維化模型、HBV相關(guān)肝纖維化病人肝組織標(biāo)本以及TGF-β刺激后的肝星狀細(xì)胞中顯著升高，并與肝纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。
　　 二、肝星狀細(xì)胞中miR-214顯著促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的活化、遷移，但是對增殖并無影響。
　　 三、細(xì)胞、組織水平證