MiR-145靶向ZEB2抑制肝星狀細(xì)胞活化增殖.pdf

1、肝纖維化是指一種或多種慢性致病因子致使肝細(xì)胞彌漫性損傷，進(jìn)而使肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell, HSC）活化增殖并導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）大量沉積的一種病理過程。HSC的活化增殖是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，抑制HSC的活化增殖可減緩或阻止肝纖維化的發(fā)生。
　　研究發(fā)現(xiàn)在機(jī)體多種組織或器官的纖維化疾病進(jìn)程中，都發(fā)現(xiàn)有microRNA（miRNA）的調(diào)控作用。MiR

2、NA能調(diào)控多種促肝纖維化或抑肝纖維化相關(guān)因子，反過來，肝纖維化的發(fā)生又能使多種miRNA表達(dá)發(fā)生變化。近年也有研究發(fā)現(xiàn)miR-145與多種纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但是miR-145在肝纖維化以及肝星狀細(xì)胞活化過程中的作用鮮有報道，這需要進(jìn)一步的研究。
　　本實驗主要觀察miR-145在肝纖維化發(fā)生過程中和HSC活化過程中的表達(dá)變化，并進(jìn)一步探討miR-145對轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor

3、-β1, TGF-β1）誘導(dǎo)的HSC活化增殖的影響及其可能的作用分子機(jī)制。研究內(nèi)容主要概況如下：
　　（1）ZEB2和miR-145在肝纖維化過程中的表達(dá)
　　體內(nèi)我們采用四氯化碳（carbon tetrachloride, CCl4）皮下注射4周建立小鼠肝纖維化模型，取肝組織進(jìn)行HE和Masson染色，同時檢測α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和I型膠原（Collagen type

4、1, Colα1）的蛋白表達(dá)鑒定模型構(gòu)建成功。通過qPCR技術(shù)檢測肝組織和原代HSC中ZEB2和miR-145的表達(dá)，同時采用免疫熒光雙染技術(shù)觀察ZEB2是否表達(dá)于肝星狀細(xì)胞中。體外我們采用不同濃度TGF-β1分別對大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6和人肝星狀細(xì)胞LX-2進(jìn)行刺激，24h后檢測ZEB2和miR-145的表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠的肝組織和原代HSC中以及體外TGF-β1處理的HSC中，miR-145的表達(dá)均是

5、降低的，而ZEB2表達(dá)水平升高。ZEB2和α-SMA雙重染色顯示，ZEB2主要表達(dá)于α-SMA陽性的細(xì)胞即HSC中。
　?。?）miR-145對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞活化增殖的影響
　　在HSC-T6中，采用miR-145 mimics和inhibitor建立過表達(dá)和沉默miR-145細(xì)胞模型，同時采用TGF-β1（10ng/ml，24h）進(jìn)行刺激，Western blot檢測處理后的HSC-T6細(xì)胞中Colα1

6、和α-SMA的蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期情況。結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-145能抑制Colα1和α-SMA的蛋白表達(dá)，同時使TGF-β1引起的HSC-T6增殖明顯減少；沉默miR-145，使TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6增殖增多，同時Colα1和α-SMA的蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步升高。
　?。?）ZEB2對TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞活化增殖的影響
　　在HSC-T6細(xì)胞中，采用ZEB2小干擾RNA（ZEB2 siRN

7、A）建立沉默ZEB2細(xì)胞模型，同時采用TGF-β1（10ng/ml，24h）進(jìn)行刺激，Western blot檢測處理后Colα1和α-SMA蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期情況。結(jié)果顯示：沉默ZEB2能抑制Colα1和α-SMA的蛋白表達(dá)，同時使TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6增殖明顯減少。
　?。?）miR-145與ZEB2之間靶向關(guān)系的研究
　　使用生物信息學(xué)軟件分析了解到miR-145同ZEB2之間存在可能的靶向關(guān)系。

8、在HSC-T6細(xì)胞中，我們采用miR-145 mimics和inhibitor建立過表達(dá)和沉默細(xì)胞模型，Western blot檢測ZEB2 mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示：過表達(dá)miR-145能抑制ZEB2 mRNA和蛋白表達(dá)，而沉默miR-145能升高ZEB2 mRNA和蛋白表達(dá)。進(jìn)一步，本課題組采用雙熒光素（螢火蟲和海腎）酶報告基因?qū)嶒灤_認(rèn)兩者的靶向關(guān)系，發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miR-145 mimics和ZEB2的3’端非編碼區(qū)（3’ u

9、ntranslated region,3’-UTR）質(zhì)粒能抑制HSC-T6細(xì)胞中ZEB23’-UTR的相對熒光值表達(dá)。
　　（5）miR-145和ZEB2對Wnt/β-catenin信號通路的影響
　　在HSC-T6中，采用miR-145 mimics、inhibitor和ZEB2 siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染以后，采用Western blot技術(shù)檢測β-catenin及其下游靶蛋白cyclinD1和c-Myc的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：過