miR-200b靶向ZEB2調(diào)控小細(xì)胞肺癌多藥耐藥性研究.pdf

1、研究背景:
　　 肺癌是當(dāng)今世界上對(duì)人類健康危害最大的惡性腫瘤之一，全國(guó)肺癌協(xié)會(huì)最新發(fā)布的調(diào)查資料顯示我國(guó)肺癌的發(fā)病率已高居各類惡性腫瘤首位。根據(jù)腫瘤組織形態(tài)學(xué)的不同，肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（smallcelllungcancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC，包括腺癌、鱗癌和大細(xì)胞癌），小細(xì)胞肺癌是支氣管肺癌中未分化癌分型，約占全部肺癌15％，由于較早發(fā)生血行轉(zhuǎn)移及淋巴轉(zhuǎn)

2、移，預(yù)后極差。雖然小細(xì)胞肺癌患者對(duì)化療藥物敏感，但由于極易出現(xiàn)多藥耐藥(multidrugresistance，MDR)而導(dǎo)致治療失敗，而且MDR導(dǎo)致的小細(xì)胞肺癌復(fù)發(fā)率很高，臨床預(yù)后差，因此，化療抗藥性已成為近年來小細(xì)胞肺癌臨床治療急需解決的重要問題之一。
　　 鋅指轉(zhuǎn)錄因子snail超家族由snail、E12/FA7、ZEB1、ZEB2及Slug五個(gè)成員組成，參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡等重要生物過程。研究發(fā)現(xiàn)snail基因家族發(fā)

3、生異常表達(dá)，可導(dǎo)致個(gè)體發(fā)育和組織器官形成過程中出現(xiàn)異常形態(tài)結(jié)構(gòu)，并在前列腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用，snail家族基因還參與腫瘤細(xì)胞耐藥和凋亡的調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)ZEB2在人，大鼠組織中廣泛表達(dá)，尤其是心臟，神經(jīng)組織。ZEB2結(jié)合E-cad基因啟動(dòng)子區(qū)的E-box序列，抑制E鈣黏蛋白、細(xì)胞角蛋白(cytokeratin)、黏蛋白，mac-1和橋粒蛋白的轉(zhuǎn)錄。這些蛋白表達(dá)的下調(diào)，尤其是E鈣黏蛋白表達(dá)的下調(diào)，對(duì)

4、于上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymaltransition，EMT)起著非常重要的作用。ZEB2基因作為snail基因家族中的重要成員，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)ZEB2與膀胱癌對(duì)表皮生長(zhǎng)因子抑制劑耐藥、卵巢癌對(duì)順鉑耐藥密切相關(guān)。然而，ZEB2基因是否參與小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡和耐藥產(chǎn)生，目前尚無相關(guān)報(bào)道。
　　 MicroRNA(miRNA)是長(zhǎng)度為19-25nt的單鏈非編碼核苷酸分

5、子，具有高度的進(jìn)化保守性，通過對(duì)靶mRNA的降解或者翻譯抑制，廣泛參與動(dòng)植物細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、分化、增殖與凋亡、激素分泌及腫瘤形成等多種重要生物過程。研究發(fā)現(xiàn)miRNA與腫瘤耐藥的產(chǎn)生也有著密切的關(guān)系。下調(diào)miRNA-200c表達(dá)，乳腺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性降低。在急性早幼粒細(xì)胞白血病中，miRNA-125b的高表達(dá)，可增加其對(duì)化療藥物的抗藥性。在結(jié)直腸癌中，上調(diào)miRNA-224可增加其對(duì)甲氨蝶呤的耐藥性。有研究發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌(NSC

6、LC)組織中經(jīng)常發(fā)生miRNA-128b雜合性的缺失，miR-128b能夠靶向調(diào)控表皮生長(zhǎng)因子受體，與患者對(duì)吉非替尼的敏感性及生存率有關(guān)。我們采用miRNA芯片比較分析小細(xì)胞肺癌耐藥細(xì)胞H69AR和非耐藥細(xì)胞H69中miRNAs的表達(dá)差異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)61個(gè)miRNAs出現(xiàn)表達(dá)異常，其中miR-375、miR-200b等24個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)，而miR-100、miR-224等37個(gè)miRNAs表達(dá)下調(diào)，芯片結(jié)果得到了實(shí)時(shí)定量PCR的

7、驗(yàn)證。
　　 miR-200家族包括miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-141，miR-429五個(gè)成員。很多研究表明，miR-200家族靶向兩個(gè)重要細(xì)胞轉(zhuǎn)錄抑制因子，即鋅指E盒子結(jié)合同源框1(ZincfingerE-box-bindinghomeobox1，ZEB1)和鋅指E盒子結(jié)合同源框2(ZincfingerE-box-bindinghomeobox2，ZEB2)，調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epitheli

8、al-mesenchymaltransitions，EMT）及間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化（mesenchymal-epithelialtransitions，MET），從而影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等生物學(xué)行為。miR-200b是重要成員之一，生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-200b的靶基因多達(dá)7000多個(gè)。Christoffersen通過原位雜交技術(shù)，檢測(cè)到大鼠大腦中miR-200b與ZEB2mRNA共同表達(dá)，上調(diào)miR-200b后ZEB2在mR

9、NA水平和蛋白質(zhì)水平都下降。
　　 我們前期采用基因芯片技術(shù)分析ZEB2基因在SCLC多藥耐藥細(xì)胞株H69AR中明顯高表達(dá)，為進(jìn)一步明確ZEB2與小細(xì)胞肺癌耐藥的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)設(shè)想通過RNA干擾技術(shù)降低小細(xì)胞肺癌細(xì)胞多藥耐藥株H69AR細(xì)胞中ZEB2表達(dá)，檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后ZEB2在mRNA及蛋白水平的變化，通過采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cellcountingkit-8，CCK8)法及流式細(xì)胞術(shù)分析ADM、DDP和VP-16作用H69A

10、R細(xì)胞藥物敏感性變化及凋亡和周期的變化。對(duì)小細(xì)胞肺癌組織標(biāo)本進(jìn)行分析，明確ZEB2的表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　 我們通過生物信息學(xué)軟件（miRanda和Targetscan軟件）預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ZEB2是miR-200b其中一個(gè)靶基因，miR-200b位于染色體2q22.3的ZEB2簇中間，miR-200b能與ZEB2mRNA的3'-UTR部分配對(duì)，因而影響其轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程。前期miRNA芯片顯示H69AR中miR-2

11、00b在H69AR中明顯低表達(dá)，與ZEB2的表達(dá)呈反向表達(dá)關(guān)系，提示miR-200b對(duì)ZEB2的可能具有靶向調(diào)控，本研究還將進(jìn)一步確定miR-200b與ZEB2基因的調(diào)控關(guān)系。
　　 研究目的:
　　 比較SCLC多藥耐藥細(xì)胞株(H69AR)和敏感細(xì)胞株(H69)中基因表達(dá)差異，選取ZEB2基因家族中表達(dá)差異顯著的成員進(jìn)行研究，分析其對(duì)SCLC耐藥性的調(diào)控作用，以及miR-200b對(duì)ZEB2基因的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步豐富SC

12、LC多藥耐藥性的分子機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 內(nèi)容與方法:
　　 一、ZEB2表達(dá)對(duì)小細(xì)胞肺癌多藥耐藥性的影響
　　 采用SiRNA降低H69AR細(xì)胞中ZEB2表達(dá)，CCK8法分析細(xì)胞對(duì)小細(xì)胞常用化療藥物順鉑(Cisplatin，DDP)、足葉乙甙(Etoposide，VP-16)及阿霉素(Doxorubicin，ADM)敏感性變化，流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期變化。
　　 二、miR-

13、200b對(duì)ZEB2的靶向調(diào)節(jié)作用
　　 1、將miR-200b模擬物(mimic)增加H69AR中miR-200b表達(dá)水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析miR-200b及ZEB2mRNA水平，WesternBlot檢測(cè)ZEB2蛋白水平的變化。
　　 2、構(gòu)建ZEB23'-非翻譯區(qū)(3'-untranslatedregion，3'-UTR)的psiCHECK-2載體(psiCHECK-2-ZEB2-3'UTR)，與miR-200

14、bmimic和inhibitor共轉(zhuǎn)染入H69AR細(xì)胞，采用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定方法檢測(cè)ZEB2熒光素酶活性。
　　 三、miR-200b對(duì)SCLC多藥耐藥性的影響
　　 采用miR-200bmimic增加H69AR、中miR-200b的表達(dá)，CCK8法分析細(xì)胞藥物敏感性的變化，確定miR-200b對(duì)SCLC耐藥性的影響。
　　 四、ZEB2在SCLC組織中的表達(dá)及臨床病理意義
　　 收集68例SCLC

15、患者石蠟包埋組織，免疫組化染色，分析ZEB2表達(dá)與SCLC患者臨床特征及生存率的關(guān)系。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有結(jié)果均經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各實(shí)驗(yàn)至少獨(dú)立重復(fù)3次，重復(fù)性好。所選圖表為3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果之一。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（-x±s）表示，實(shí)時(shí)定量PCR、westernblotting、凋亡及周期實(shí)驗(yàn)、熒光素酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)采用one-wayANOVA（方差齊時(shí)）或近似F檢驗(yàn)Welch法（方差

16、不齊）;組間兩兩比較采用LSD法（方差齊時(shí)）或Dunnett'sT3法（方差不齊）。CCK8采用兩因素析因設(shè)計(jì)的方差分析，多重比較用SNK法。同一組內(nèi)不同濃度間比較和同一濃度不同組間比較用one-wayANOVA。參數(shù)比較前均先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差不齊用基于方差不齊的近似F檢驗(yàn)Welch法。ZEB2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系分析采用Fisher's精確分析。ZEB2表達(dá)與生存率的關(guān)系采用Kaplain-Meier分析。以P＜0.05表

17、示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 一、下調(diào)ZEB2的表達(dá)顯著增加H69AR細(xì)胞的藥物敏感性
　　 1、ZEB2明顯降低ZEB2在H69AR細(xì)胞中的表達(dá)
　　 設(shè)計(jì)合成了三對(duì)針對(duì)ZEB2的siRNA寡核苷酸，采用lipofectamin2000轉(zhuǎn)染H69AR細(xì)胞。三組間mRNA和蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ZEB2-642組mRNA和蛋白水平較其它兩組明顯降低(P＜0.001)。因此選擇ZEB2-64

18、2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2、CCK-8法分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染ZEB2-642的H69AR細(xì)胞對(duì)藥物的生存率較陰性對(duì)照(negativecontrol，NC)組和空白對(duì)照組明顯降低（P＜0.001），IC50值亦顯著降低。
　　 3、流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，ADM、DDP和VP-16處理后，轉(zhuǎn)染ZEB2-642的H69AR細(xì)胞的凋亡率較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組升高，細(xì)胞周期發(fā)生改變。
　　 二、ZEB2是miR-200

19、b的靶基因
　　 1、miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件(PicTar,TarScan和miRBase)分析顯示，miR-200b與ZEB23'-UTR具有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)。
　　 2、miR-200b對(duì)ZEB2蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用
　　 將miR-200bmimic轉(zhuǎn)染H69細(xì)胞后，miR-200b表達(dá)增加(P＜0.001)，ZEB2蛋白水平降低(P＜0.001)，ZEB2mRNA水平無明顯變化。
　　 3、ZEB2是

20、miR-200b的靶基因
　　 (1)成功構(gòu)建psiCHECK-2-ZEB2-YUTR-R載體
　　 通過PCR擴(kuò)增ZEB23'-UTR，產(chǎn)物長(zhǎng)度為1512bp，經(jīng)轉(zhuǎn)化、抗性篩選、挑取單克隆等步驟后試劑盒提取質(zhì)粒，Not(I)和Xho(I)雙酶切，產(chǎn)物大小約為6273bp/1512bp。酶切鑒定psiCHECK-2-ZEB2-YUTR克隆1-4和psiCHECK-2-ZEB2-YUTR-R克隆3正確，挑起psiCHECK

21、-2-ZEB2-YUTR-1號(hào)克隆和psiCHECK-2-ZEB2-3'UTR-R-3號(hào)克隆進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與理論序列一致，試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 (2)ZEB2熒光素酶活性受miR-200bmimic和inhibitor調(diào)節(jié)
　　 將psiCHECK-2-ZEB2-3'UTR-R或psiCHECK-2-ZEB2-3'UTR-mut載體轉(zhuǎn)染入H69AR細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染miR-200b或inhibitor，檢測(cè)Z

22、EB2熒光素酶活性發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-200b可顯著抑制轉(zhuǎn)染ZEB23'-UTR的H69AR細(xì)胞中ZEB2熒光素酶活性（P＜0.001），miR-200binhibitor可顯著增加轉(zhuǎn)染ZEB2的H69AR細(xì)胞中ZEB2熒光素酶活性(P＜0.001)。miR-200b和miR-200binhibitor對(duì)轉(zhuǎn)染ZEB23'UTR-mut的H69AR細(xì)胞中ZEB2熒光素酶活性無影響。
　　 三、增加miR-200b表

23、達(dá)能降低H69AR細(xì)胞對(duì)ADM、DDP和VP-16的耐藥性
　　 轉(zhuǎn)染miR-200bmimic的H69AR細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組增加(P＜0.001)，IC50值亦降低。
　　 四、ZEB2在SCLC組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系
　　 ZEB2陽性表達(dá)位于胞核，在SCLC組織中陽性表達(dá)率為23.5％(16/68)，ZEB2陽性表達(dá)率在性別、年齡及生存狀態(tài)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.492，

24、0.776，0.098)。ZEB2在局限期(LD)患者中的陽性表達(dá)率為(7.6％)低于廣泛期(ED)患者(80.0％)，兩者的ZEB2陽性表達(dá)率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。
　　 五、SCLC患者生存分析
　　 Kaplan-Meier法分析患者生存率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)男性患者與女性患者的生存率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.152）。不超過57歲的患者與高于57歲以上患者生存率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.097）。局限期患者的生存率高于

25、廣泛期患者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。ZEB2陰性患者的生存率高于ZEB2陽性患者，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1、ZEB2在SCLC多藥耐藥株H69AR中表達(dá)增加，下調(diào)ZEB2能夠降低H69AR細(xì)胞對(duì)ADM、DDP、VP-16等化療藥物的耐藥性，表明ZEB2參與了SCLC的多藥耐藥。
　　 2、miR-200b在SCLC多藥耐藥株H69AR中表達(dá)降低，通過ZEB23'-UTR