涎腺腺樣囊性癌耐藥細(xì)胞系的建立及其多藥耐藥性的初步研究.pdf

1、腺樣囊性癌（ACC，adenoid cystic carcinoma）是涎腺最常見的惡性腫瘤之一，其治療以綜合治療為主，對(duì)于不能手術(shù)的腫瘤或者不能切除的復(fù)發(fā)病例，化療是主要的治療手段。因此由于長(zhǎng)期使用一種藥物而產(chǎn)生的對(duì)其他多種藥物耐藥的特性，即多藥耐藥（MDR，Multidrug resistance）的產(chǎn)生而導(dǎo)致的治療失敗在臨床上很常見。
　　目前研究最廣泛的耐藥機(jī)制就是細(xì)胞將藥物泵出的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括P-糖蛋白（P

2、-gp，p-glycoprotein）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP，Multidrug resistance-associated protein）等。MRP與P-gp多藥耐藥譜相似，但也不盡相同，兩者通過轉(zhuǎn)運(yùn)化療藥物產(chǎn)生MDR的機(jī)制也有差別。目前認(rèn)為MRP也是一種ATP依賴泵，能將帶負(fù)電荷的藥物分子逆濃度泵出到細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤耐藥的發(fā)生。
　　逆轉(zhuǎn)多藥耐藥最引人注目的是RNA干涉（RNAi，RNA interf

3、erence）技術(shù)。用RNAi技術(shù)沉默多藥耐藥基因（MDR gene，Multidrug resistance gene），抑制P-gp表達(dá)，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞耐藥性已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，但是以RNAi技術(shù)沉默多藥耐藥相關(guān)基因（MRP gene，Multidrug resistance-associated gene），抑制MRP蛋白表達(dá)卻少見報(bào)道。
　　博萊霉素（BLM，Bleomycin）是治療頭面部腫瘤的常用藥物，本研究通過采用大劑量

4、BLM反復(fù)作用于腺樣囊性癌細(xì)胞（ACC-2），建立了耐藥細(xì)胞系A(chǔ)CC-2/BLM，為探討涎腺癌耐藥機(jī)制以及逆轉(zhuǎn)耐藥提供體外研究模型。繼而針對(duì)在ACC-2/BLM耐藥細(xì)胞中高表達(dá)的MRP1基因，設(shè)計(jì)合成shRNA片段，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染ACC-2/BLM細(xì)胞，驗(yàn)證了shRNA設(shè)計(jì)與合成的合理性，可以得出RNAi技術(shù)同樣可以干涉MRP1基因表達(dá)的結(jié)論，為進(jìn)一步檢測(cè)腫瘤耐藥性逆轉(zhuǎn)效果提供研究基礎(chǔ)。
　　研究?jī)?nèi)容:
　　1、采用大劑量BL

5、M（20μg/ml）24小時(shí)暴露法反復(fù)處理腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-2細(xì)胞，獲得耐藥細(xì)胞系A(chǔ)CC-2/BLM；通過MTT法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞術(shù)等方法，觀察ACC-2/BLM細(xì)胞的生物學(xué)特性的變化。
　　2、應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR，reverse transcription polymerase chain reaction）檢測(cè)MDR1和MRP1mRNA表達(dá)以及應(yīng)用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色間接法檢測(cè)相應(yīng)的P-gp和MR

6、P蛋白在ACC-2和ACC-2/BLM細(xì)胞中的表達(dá)。
　　3、按照siRNA設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)4條針對(duì)MRP1基因的shRNA，構(gòu)建pGPU6/GFP/Neo-MRP1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染ACC-2/BLM細(xì)胞，通過RT-PCR分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染24h、48h和72h后MRP1基因沉默情況。
　　4、應(yīng)用基因芯片篩選ACC-2與ACC-2/BLM細(xì)胞表達(dá)差異基因，并初步分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、建立了博萊霉素誘導(dǎo)的人口

7、腔涎腺腺樣囊性癌耐藥細(xì)胞系A(chǔ)CC-2/BLM，耐藥指數(shù)為7.299，與5-氟尿嘧啶（5-FU，5-Fluorouracil）、順鉑（CDDP，Cisplatin）、環(huán)磷酰胺（CTX，Cyclophosphamide）、長(zhǎng)春新堿（VCR，Vincristine）等抗癌藥有明顯的交叉耐藥，耐藥指數(shù)分別為1.03、2.15、1.114、5.96；與ACC-2細(xì)胞相比，ACC-2/BLM細(xì)胞倍增時(shí)間延長(zhǎng)，S期細(xì)胞減少，G1、G2期細(xì)胞增多，克隆

8、形成率增加，細(xì)胞溶酶體增多。
　　2、RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示ACC-2以及ACC-2/BLM細(xì)胞均不表達(dá)MDR1基因，而MRP1基因在ACC-2/BLM細(xì)胞中的表達(dá)明顯強(qiáng)于ACC-2細(xì)胞。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，在ACC-2/BLM細(xì)胞中MRP蛋白表達(dá)也強(qiáng)于ACC-2細(xì)胞。
　　3、轉(zhuǎn)染24h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染不同片段shRNA的ACC-2/BLM細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率相近，約為40-50％。RT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染第

9、四個(gè)shRNA片段的ACC-2/BLM細(xì)胞，MRP1mRNA在72h時(shí)表達(dá)水平明顯下降。
　　4、以ACC-2細(xì)胞以及ACC-2/BLM細(xì)胞為模型，應(yīng)用基因表達(dá)譜芯片篩選多藥耐藥相關(guān)基因，41000個(gè)基因中篩選出上調(diào)基因有514個(gè)，下調(diào)基因有469個(gè)。
　　結(jié)論:
　　1、大劑量24小時(shí)暴露法可使BLM致ACC-2細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，ACC-2/BLM細(xì)胞系具有多藥耐藥特性，屬于中等耐藥。
　　2、MRP1基因及其編

10、碼的MRP蛋白在ACC-2/BLM細(xì)胞中的高表達(dá)，可能與ACC-2/BLM細(xì)胞系產(chǎn)生多藥耐藥性有關(guān)。
　　3、成功構(gòu)建了能表達(dá)MRP1shRNA的質(zhì)粒載體pGPU6/GFP/Neo-MRP1，并且可以有效的降低MRP1mRNA表達(dá)水平，說明MRP1shRNA干涉序列設(shè)計(jì)合理，所合成的shRNA能夠特異性阻斷MRP1基因在ACC-2/BLM細(xì)胞中的表達(dá)。
　　4、ACC-2/BLM細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性與眾多基因相關(guān)，其機(jī)制和原因