乳腺癌耐藥蛋白高表達耐藥細胞系的建立及其耐藥機制.pdf

1、目的：建立穩(wěn)定表達乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)的小鼠成纖維細胞系PA317/BCRP，進一步研究BCRP相關的耐藥功能，初步探討其耐藥機制，為逆轉其耐藥提供依據(jù)。 方法：首先，從表達BCRP的乳腺癌耐阿霉素細胞系MCF-7/Adr中，克隆出BCRP基因。將BCRP編碼序列克隆入真核表達載體pcDNA3.1，轉化感受態(tài)E.ColiDH5α，獲得重組質粒pcDNA3.1/BCRP，酶切并測序鑒定。我們將測序正確的質粒用電穿孔法轉染PA

2、317細胞，同時轉染pcDNA3.1/EGFP以觀察轉染率。G418篩選陽性克隆，有限稀釋法獲取單克隆后擴大培養(yǎng)。從G418篩選出的陽性轉染細胞中提取細胞總RNA，RT-PCR法檢測BCRP的mRNA表達，運用WESTERNBLOT法和免疫組織化學法檢測BCRP蛋白在細胞膜上的表達。經驗證正確的耐藥克隆命名為PA317/BCRP，擴大培養(yǎng)并凍存。為驗證其耐藥功能，我們采用MTT法檢測PA317/BCRP細胞對米托葸醌(Mitoxantr

3、one，MTZ)耐藥性，羅丹明123外排實驗驗證轉染后細胞外排羅丹明123功能，均以轉染空質粒的PA317細胞及未轉染細胞作為對照。此外，應用Westernblot檢測PI3K-AKT信號轉導通路下游靶點AKT表達含量的變化，以初步探討其細胞耐藥機制。 結果：成功構建質粒pcDNA3.1/BCRP，轉染PA317細胞后經G418篩選，克隆化培養(yǎng)后獲得兩株抗藥性細胞系。經RT-PCR法，Westernblot和免疫組化法驗證，均檢

4、測到細胞中BCRP基因轉錄及蛋白表達。遂將驗證正確的細胞系命名為PA317/BCRP，擴大培養(yǎng)并凍存。與空質粒轉染細胞、未轉染細胞對照組相比，PA317/BCRP細胞對MTZ耐藥性增強，且外排羅丹明123能力增強。耐藥機制方面，我們經檢測PI3K-AKT途徑下游靶點AKT蛋白磷酸化水平在PA317/BCRP細胞內明顯增高，其磷酸化AKT蛋白含量為PA317/pcDNA3.1細胞的10.87倍，為未轉染PA317細胞的13.18倍。

5、 結論：1、成功獲得穩(wěn)定表達BCRP的PA317細胞系--PA317/BCRP，經MTT和羅丹明123外排實驗證實，相對于轉染空質粒和未轉染的PA317細胞，其耐藥和外排功能增強。該耐藥細胞系的建立，為研究BCRP腫瘤多藥耐藥提供了研究平臺。2、通過檢測PA317/BCRP細胞PI3K-AKT途徑下游靶點AKT的表達，我們觀察到耐藥細胞的AKT表達含量明顯高于轉染空質粒和未轉染的PA317細胞。因此，我們認為BCRP可能通過影響AKT