2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、目的:
  近年來(lái),隨著腫瘤個(gè)體化靶向治療的迅速發(fā)展,以吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)為代表的表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermalgrowth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)在EGFR陽(yáng)性突變的晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者中療效顯著。但隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)

2、(12-14個(gè)月),患者最終對(duì)其產(chǎn)生耐藥性,病情復(fù)發(fā)或進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn),EGFR-TKI潛在的耐藥機(jī)制是復(fù)雜和多樣的,涉及靶蛋白的改變或EGFR的T790M繼發(fā)突變、EGFR下游通路中PI3K、KRAS、BRAF等基因突變、c-Met擴(kuò)增或HGF過(guò)表達(dá)、發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和向小細(xì)胞類型轉(zhuǎn)化(small cell lung cancer,SCLC)等,但是還有20-

3、30%的耐藥機(jī)制不明確,可能與表觀遺傳學(xué)、代謝異常等有關(guān)。腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展都會(huì)產(chǎn)生大量的代謝物變化,所以腫瘤也是一種代謝性疾病。利用代謝組學(xué)的方法尋找親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞之間差異的代謝物,有助于了解耐藥發(fā)生的機(jī)制,尋找新的潛在藥物靶點(diǎn)。
  方法:
  本研究中我們選用三種不同的NSCLC細(xì)胞株A549(EGFR野生型)、PC-9(EGFR敏感突變型)和H1975(EGFR T790M繼發(fā)突變型),DNA直接測(cè)序法檢測(cè)A549

4、、PC-9和H1975的EGFR突變狀態(tài);采用國(guó)產(chǎn)的EGFR-TKI(埃克替尼,icotinib)在體外以小劑量濃度梯度遞增法誘導(dǎo)建立??颂婺崮退幹闍549/IR、PC-9/IR和H1975/IR。從不同角度對(duì)耐藥株進(jìn)行鑒定:3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法(3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT)檢測(cè)PC-9/IR的

5、耐藥性及耐藥穩(wěn)定性;光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化;DNA測(cè)序法檢測(cè)EGFR的T790M狀態(tài);應(yīng)用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)EGFR及其旁路信號(hào)相關(guān)分子的表達(dá);小鼠移植瘤模型檢測(cè)PC-9/IR耐藥細(xì)胞在體內(nèi)的增殖能力。分別收集親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞利用核磁共振分析技術(shù)手段分析親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的差異代謝物,通過(guò)主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘法-判別分析(par

6、tial least squares discriminant analysis,PLS-DA)分析得出載荷圖和VIP(variable importance in projection,VIP)圖,找到區(qū)分親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞貢獻(xiàn)最大的代謝物。通過(guò)對(duì)差異代謝物代謝通路的分析推測(cè)可能的藥物作用靶點(diǎn),并檢測(cè)針對(duì)此靶點(diǎn)的抑制劑對(duì)PC-9/IR耐藥細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響,以及與此靶點(diǎn)相關(guān)的蛋白質(zhì)在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中的表達(dá)情況。
  結(jié)

7、果:
  歷時(shí)近8個(gè)月獲得??颂婺崮退幹闍549/IR(A549/Icotinib resistant)和H1975/IR,近6個(gè)月獲得PC-9/IR耐藥細(xì)胞。MTT法檢測(cè)到A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR對(duì)埃克替尼耐藥,且PC-9/IR耐藥細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度(50% inhibitingconcentration,IC50)是21.49μmol/L,高于PC-9親本細(xì)胞的IC50值1.32μmol/L,達(dá)到高度耐

8、藥狀態(tài);A549/IR耐藥細(xì)胞的IC50為173.73μmol/L,高于A549親本細(xì)胞的IC50值17.46μmol/L; H1975/IR耐藥細(xì)胞的IC50為196.73μmol/L,高于H1975親本細(xì)胞的IC50值23.93μmol/L。
  對(duì)PC-9/IR耐藥的穩(wěn)定性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在2μmol/L??颂婺嶂谐掷m(xù)培養(yǎng)PC-9/IR4個(gè)月,其耐藥性依然穩(wěn)定;PC-9/IR耐藥細(xì)胞未發(fā)生T790M繼發(fā)突變。PC-9/IR耐藥細(xì)胞中

9、EGFR、PI3K、AKT、STAT3和c-Met的表達(dá)水平較親本株高,分別為12.09、5.73、3.72、7.44和5.31倍;??颂婺岵荒芤种芇C-9/IR耐藥細(xì)胞中AKT和STAT3的活化且多藥耐藥蛋白ABCG2(ATP-binding cassette superfamily Gmember2,ABCG2)在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)量升高;結(jié)合c-Met及下游分子在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)升高且利用c-Met抑制劑(克

10、唑替尼,crizotinib)可以抑制PC-9/IR耐藥細(xì)胞體外、體內(nèi)的增殖,提示PC-9/IR耐藥細(xì)胞發(fā)生了c-Met旁路活化。
  核磁共振分析技術(shù)得到A549/IR、H1975/IR、PC-9/IR和A549、PC-9、H1975的代謝指紋圖譜,分析6大類包括氨基酸及衍生物、有機(jī)酸類、糖類、醇類、核苷酸組分等共62種代謝物的濃度。運(yùn)用PCA主成分分析和PLS-DA多元統(tǒng)計(jì)分析得到親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞代謝輪廓相異,并分別得出VI

11、P值大于1的15種區(qū)分親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞代謝差異的代謝物。三種不同EGFR狀態(tài)的細(xì)胞系,篩選得到的區(qū)分親本細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的差異代謝物不完全相同:區(qū)分PC-9細(xì)胞和PC-9/IR耐藥細(xì)胞的標(biāo)志差異代謝物是谷氨酸,醋酸鹽、尿酸、膽堿和丙氨酸;區(qū)分A549和A549/IR細(xì)胞的差異代謝物是谷氨酸、谷氨酰胺、乳酸、天冬氨酸和谷胱甘肽;區(qū)分H1975細(xì)胞和H1975/IR耐藥細(xì)胞的差異代謝物是乳酸、谷氨酸、?;撬帷⒋姿猁}和脯氨酸。
  PC

12、-9/IR耐藥細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)谷氨酰胺存在濃度依賴性,促進(jìn)谷氨酰胺酶表達(dá)的c-Myc基因在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)升高且??颂婺岵荒芤种芻-Myc在PC-9/IR耐藥細(xì)胞中表達(dá)。谷氨酰胺酶抑制劑Compound968可以抑制PC-9/IR耐藥細(xì)胞在體外的增殖。
  結(jié)論:
  成功建立了A549/IR、H1975/IR和PC-9/IR三株耐藥細(xì)胞。研究結(jié)果提示PC-9/IR的耐藥與c-Met活化、ABCG2表達(dá)升高及代謝變化

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