絨癌耐藥細胞株的建立及耐藥基因逆轉(zhuǎn)的研究.pdf

1、該研究擬應(yīng)用基因工程技術(shù)將細胞因子基因(IL-2)導(dǎo)入已建立的絨癌耐藥細胞株,觀察細胞因子基因轉(zhuǎn)導(dǎo)對絨癌細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用.研究內(nèi)容:一、建立絨癌耐藥細胞株,采用濃度遞增法和間歇誘導(dǎo)的方法,用5-Fu,MTX,VP-16誘導(dǎo)絨癌細胞株JEG-3建立6個耐細胞株,JEG-3/Fu1,JEG-3/Fu2,JEG-3/MTX1,JEG-3/MTX2,JEG-3/VP1和JEG-3/VP2,采用MTT法測定耐藥細胞株對5-Fu,MTX,KSM

2、,VP-16和Taxol的耐藥指數(shù),用RT-PCR測定親本細胞及各耐藥細胞株耐藥相關(guān)基因(LRP,MRP,GST-π,DHFR,MDR-1)的表達,比較各種細胞生長曲線,群體細胞的倍半時間,分泌β-HCG的差異,以了解獲得性耐藥的機理.二、IL-2基因的轉(zhuǎn)染對絨癌耐藥細胞株耐藥性的影響.用RT-PCR的方法克隆人的IL-2基因,將IL-2基因插入真核表達載體pcDNA3.1(+)中,提取質(zhì)粒,用陽離子脂質(zhì)體將IL-2基因轉(zhuǎn)入VP-16誘

3、導(dǎo)的耐藥細胞株JEG-3/VP2中,用G418篩選含IL-2 DNA片段的單細胞克隆,檢測轉(zhuǎn)染后細胞對5-Fu,MTX,VP-16,KSM,TAXOL耐藥指數(shù)的變化,比較轉(zhuǎn)染前后細胞生長曲線的變化,用流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染前后細胞DNA的含量,比較細胞周期的變化.用RT-PCR的方法測定轉(zhuǎn)染前后細胞的多種耐藥基因的表達情況.結(jié)論:1、JEG-3細胞株在誘導(dǎo)耐藥前,有多種耐藥基因MRP,LRP,GST-π,DHFR的共表達,而無MDR-1的表

4、達.用VP-16,5-Fu采用間歇誘導(dǎo)的方法誘導(dǎo)形成有耐藥細胞株MDR-1表達增強,其它耐藥基因的表達無改變.用MTX誘導(dǎo)的耐藥細胞株及用VP-16,5-Fu持續(xù)誘導(dǎo)形成的耐藥細胞株無MDR-1的表達,而各耐藥細胞株的R的表達與誘導(dǎo)前相比無明顯變化.2、采用MTX、VP-16及5-Fu誘導(dǎo)JEG-3耐藥建立的耐藥細胞株雖然藥基因的表達不同,但都有多藥耐藥現(xiàn)象,說明不同的誘導(dǎo)方式,不同的藥物誘導(dǎo)同一細胞株獲得耐藥的機制各不相同.國外僅見有

5、用MTX誘導(dǎo)絨癌細胞耐藥的報道,未見用5-Fu及VP-16誘導(dǎo)絨癌細胞耐藥的報道.3、克隆了人IL-2基因,并且將人IL-2基因通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人絨癌的耐藥細胞株JEG-3/VP2,用G418篩選出單細胞克隆,用RT-PCR的方法在轉(zhuǎn)染的細胞中檢測互IL-2 mRNA的表達.4、誘導(dǎo)耐藥前JEG-3細胞無MDR1的表達,用VP-16采用間歇誘導(dǎo)的方法建立的耐藥細胞株MDR1的表達增強,對VP-16的耐藥指數(shù)為38.7,IL-2基因轉(zhuǎn)染耐藥