人成骨肉瘤耐甲氨蝶呤細胞株建立及耐藥機制的探討.pdf

1、目的：建立人成骨肉瘤耐甲氨蝶呤細胞系，對其生物學特性及其耐藥機制進行初步探討。 方法: 以甲氨喋呤藥物（methotrexate，MTX）為誘導劑，采用沖擊法逐步增加劑量誘導人成骨肉瘤原代細胞系（Saos-2），建立耐甲氨喋呤細胞系(Saos-2/MTX4.4)；MTT檢測耐藥細胞株對 MTX、順鉑（Cisplatin,DDP）、阿霉素（doxorubicin，ADM）、異環(huán)磷酰胺（Ifosfamide，IFO）、表柔比星（Ep

2、irubicine，EPI）、比柔比星（Pirarubicin，THP）、紫杉醇（Paclitaxel，TAX）耐藥敏感性；計算其半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥指數(shù)，細胞抑制率＝（1-耐藥組平均吸光度值/對照組平均吸光度值）×100％，計算耐藥指數(shù)= IC50（Saos-2/MTX4.4/ IC50（Saos-2）；利用光學顯微鏡觀察細胞一般形態(tài)的變化，透射電鏡觀察細胞系超微結構變化；計數(shù)不同培養(yǎng)時間點細胞數(shù)目變化，繪制細胞生長曲線，檢

3、測細胞增殖能力；利用流式細胞儀檢測不同細胞系細胞周期比例變化，檢測不同耐藥系細胞增殖能力；用RT-PCR方法檢測不同細胞系還原性葉酸載體（reduced folate carrier ， RFC）基因的mRNA的表達，半定量對比測定不同細胞系的RFC基因mRNA表達；用液閃液儀檢測在含一定濃度3H-MTX培養(yǎng)液里不同時間進入Saos-2與Saos-2/MTX4.4細胞系內的藥物濃度，檢測不同細胞系的RFC基因的功能，初步探討細胞產生耐藥

4、的機制。 結果：經過27周的誘導，建立不同藥物濃度沖擊誘導的人骨肉瘤耐MTX細胞系（Saos-2/MTX1.0、 Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4），并對Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4細胞系與原代細胞系進行對比實驗；光鏡下觀察Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4細胞系表現(xiàn)為細胞體積增大，胞漿更豐富，多角形及多核細胞數(shù)量較原代Saos-2細胞系明顯增多；透射電鏡顯示S

5、aos-2/MTX2.2、Saos-2/MTX4.4細胞株表面突起較原代Saos-2細胞株減少、且核仁增大；細胞生長曲線形態(tài)顯示耐藥細胞系生長曲線斜率較原代細胞減小，生長時間延長；流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，耐藥細胞系S期細胞所占比例減少，表明耐藥系增殖能力下降。MTT檢測結果表明，Saos-2細胞系對MTX的IC50為25.78±0.29 ng/ml，Saos-2/MTX2.2對MTX的IC50為125.56±0.24 ng/ml；S

6、aos-2/MTX4.4對MTX的IC50為328.24±0.29 ng/ml；其耐藥倍數(shù)分別為4.87和12.73；耐藥細胞株對ADM、EPI、THP、TAXOL亦產生不同程度的交叉耐藥，Saos-2與Saos-2/MTX4.4間IC50存在顯著差異（P<0.05）,而對DDP無明顯耐藥性(P>0.05)；用RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn)藥物誘導細胞系的RFC基因mRNA表達較原代細胞系Saos-2的RFC基因mRNA表達明顯下降，耐藥細胞

7、系Saos-2/MTX2.2和Saos-2/MTX4.4的RFC基因mRNA是原代的24.45和31.70倍；用液閃液儀檢測發(fā)現(xiàn)：在含3H-MTX培養(yǎng)液培養(yǎng)不同細胞系，進入細胞的達峰時間均為30min，50min時細胞內的藥物濃度達平臺期，耐藥細胞系平臺期的細胞內藥物濃度是原代細胞系平臺期藥物濃度的2.15倍。 結論: 本實驗建立了耐MTX人成骨肉細胞株Saos-2/MTX2.2、Saos-2/MTx4.4，并在基因水平探討的耐