S100A6對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株的作用及信號(hào)分子β-catenin與該作用的關(guān)系.pdf

1、研究背景和目的： 腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素作用、多基因參與、經(jīng)歷多個(gè)階段的復(fù)雜生物學(xué)過(guò)程，有許多信號(hào)分子參與其中。這些信號(hào)分子對(duì)腫瘤的作用、作用機(jī)制以及信號(hào)分子之間的相互關(guān)系都很復(fù)雜，尚未闡明。 S100蛋白家族是一類(lèi)具有EF-手形結(jié)構(gòu)的鈣結(jié)合蛋白信號(hào)分子，至少有25個(gè)成員。其多個(gè)成員在腫瘤中表達(dá)異常，并參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移。S100A6是該家族的一員，其基因定位于人染色體1q21，該區(qū)的穩(wěn)定性較差，易

2、發(fā)生多種染色體重排和基因擴(kuò)增，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。在骨肉瘤病人的該染色體位點(diǎn)往往存在異常；同時(shí)，已有報(bào)道該蛋白在骨肉瘤中表達(dá)增高，并且可能參與調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的遷移等。提示S100A6可能參與骨肉瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，但其具體作用及機(jī)制尚待研究。本課題擬探討S100A6對(duì)入骨肉瘤細(xì)胞株MG63和U20S的增殖、凋亡和遷移的作用及可能機(jī)制。 Wnt/β-catenin信號(hào)途徑是公認(rèn)的與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)途徑，β-cateni

3、n是其關(guān)鍵的信號(hào)分子。胞漿中β-catenin增多后，可轉(zhuǎn)移到胞核，進(jìn)而與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，導(dǎo)致該信號(hào)途徑下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活；這些靶基因（如c-myc、細(xì)胞周期素D1等）具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移等作用。β-catenin的高表達(dá)和該信號(hào)途徑的失調(diào)常見(jiàn)于大多數(shù)腫瘤，包括骨肉瘤。 基于S100A6的高表達(dá)與β-catenin的高表達(dá)常常同時(shí)存在于骨肉瘤以及本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)--S100A6與Wnt/β-catenin信號(hào)通路

4、中的多個(gè)效應(yīng)分子（包括β-catenin）之間在體外存在特異性直接相互作用，我們假設(shè)S100A6對(duì)骨肉瘤的作用可能涉及Wnt/β-catenin信號(hào)途徑。因此，本課題擬探討S100A6對(duì)信號(hào)分子β-catenin表達(dá)的影響及β-catenin與S100A6對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用之間的關(guān)系。 我們通過(guò)重組hS100A6蛋白直接作用的方式和/或用重組腺病毒感染的方式分別轉(zhuǎn)入hS100A6基因及其SiRNA基因、β-catenin基因及其

5、SiRNA基因，探討hS100A6對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株MG63和U2OS細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡的作用及對(duì)β-catenin的影響；在此基礎(chǔ)之上，通過(guò)分別上調(diào)和下調(diào)β-catenin的表達(dá)，探討信號(hào)分子β-catenin與S100A6對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞的作用之間的關(guān)系，為闡明S100A6對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用及信號(hào)分子β-catenin在該作用中的意義積累更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為發(fā)現(xiàn)骨肉瘤診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物以及治療的新靶點(diǎn)提供線(xiàn)索。 方法：

6、 1.重組蛋白GST-hS100A6的制備及相關(guān)腺病毒的擴(kuò)增：將質(zhì)粒pGST-Moluc-hS100A6和pGST-Moluc轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)GST-hS100A6和GST蛋白表達(dá)，谷胱甘肽-瓊脂糖4B球珠（Glutathione Sepharose4B beads）分離純化，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylam

7、ide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和Western blot鑒定這兩種重組蛋白，BCA法定量，分裝后-80℃保存?zhèn)溆谩?2.利用HEK293細(xì)胞擴(kuò)增攜帶hS100A6和β-catenin基因的重組腺病毒（AdS100A6和Adβ-catenin）、攜帶它們特異的SiRNA基因的的重組腺病毒（AdSiS100A6和AdSiβ-catenin）和對(duì)照腺病毒（AdGFP和AdRFP）。 3.蛋白

8、終濃度為100μg/ml的重組hS100A6（GST-hS100A6）作用人骨肉瘤細(xì)胞株MG63和U20S后，分別用MTT法和臺(tái)盼蘭染色/活細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞的增殖；Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡；劃痕愈合實(shí)驗(yàn)（wound healing assay）和Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力。 4.通過(guò)重組腺病毒分別上調(diào)和下調(diào)人骨肉瘤細(xì)胞S100A6的表達(dá)后，用RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中β-catenin mRNA的表達(dá)；We

9、stern blot和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)β-catenin蛋白的表達(dá)。 5.通過(guò)重組腺病毒分別上調(diào)和下調(diào)β-catenin的表達(dá)后，用MTT法檢測(cè)GST-hS100A6對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株MG63和U2OS增殖的影響，用Hoechst染色檢測(cè)GST-hS100A6對(duì)細(xì)胞凋亡作用的影響，用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell小室檢測(cè)GST-hS100A6對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響。 結(jié)論： 1.S100A6對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株MG63

10、和U2OS均有一定的抑制增殖、促進(jìn)凋亡的作用。 2.S100A6對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞株MG63有明顯的抑制遷移的作用，但對(duì)U2OS的遷移無(wú)明顯影響。 3.S100A6能夠增加人骨肉瘤細(xì)胞株U2OS和MG63的β-catenin mRNA水平和蛋白水平，并促進(jìn)β-catenin向胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移；S100A6在骨肉瘤的高表達(dá)可能是導(dǎo)致骨肉瘤中β-catenin增加和其中Wnt/β-catenin信號(hào)途徑失調(diào)的機(jī)制之一。 4.β

11、-catenin能夠明顯減弱或拮抗S100A6對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和遷移的抑制作用，并同時(shí)增強(qiáng)S100A6對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的促凋亡作用。 5.綜上，我們推測(cè)：S100A6對(duì)骨肉瘤的抑制性作用可能是經(jīng)由其它信號(hào)途徑介導(dǎo)的，該途徑與S100A6激活的Wnt/β-catenin信號(hào)途徑相互拮抗，共同精細(xì)地調(diào)節(jié)著骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡。 本研究為闡明S100A6對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的作用、作用機(jī)制以及β-caterun與這些作用之間的關(guān)