人骨肉瘤細(xì)胞株和成骨細(xì)胞株差異蛋白的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、第一章SV40永生化成骨細(xì)胞hFOB1.19成骨性、成瘤性驗(yàn)證以及試驗(yàn)體系的建立。 目的：骨肉瘤作為最常見的惡性骨腫瘤，仍缺乏特異性的蛋白分子標(biāo)志，篩選骨肉瘤特異性蛋白有利于發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和開展腫瘤早期診斷。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用人骨肉瘤細(xì)胞系和SV40永生化的成骨細(xì)胞系hFOB1.19作對(duì)照，篩選骨肉瘤差異表達(dá)蛋白。首先對(duì)SV40永生化的hFOB1.19成骨和成瘤性進(jìn)行驗(yàn)證，建立試驗(yàn)對(duì)照體系。 方法：常規(guī)培養(yǎng)骨肉瘤細(xì)胞U

2、2-OS、IOR/OS9、SaOS-2和成骨細(xì)胞hFOB1.19。待成骨細(xì)胞hFOB1.19生長至融合時(shí)，采用鈣鈷法和α-萘基磷酸染色，顯示hFOB1.19細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)表達(dá)，取3張玻片，每張玻片隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞的比率。長期培養(yǎng)的成骨細(xì)胞觀察其鈣化結(jié)節(jié)的形成，以茜素紅染色顯示。將成骨細(xì)胞hFOB1.19和骨肉瘤細(xì)胞IOR/OS9分別接種于5只BALB/c-nu/nu裸鼠的頸部和腹股溝皮下，于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)8

3、周，觀察裸鼠皮下成瘤情況，取皮下瘤測量體積和重量，腫瘤組織行常規(guī)切片HE染色。 結(jié)果：SV4.0永生化的成骨細(xì)胞hFOB1.19呈短梭形、類梭形，多角形，較飽滿，胞漿豐富，排列整齊有序，具有典型的成骨細(xì)胞形態(tài)。ALP的鈣鈷法染色顯示陽性細(xì)胞胞漿內(nèi)呈灰黑色、棕黑色顆粒，α-萘基磷酸法染色陽性細(xì)胞呈淺褐色、褐色。陽性細(xì)胞多為多角形、細(xì)胞體積大，多角形細(xì)胞聚集處ALP染色強(qiáng)陽性。計(jì)數(shù)3張玻片ALP陽性細(xì)胞為176±8，陽性率為88.0

4、﹪。hFOB1.19長期培養(yǎng)(20天)細(xì)胞呈復(fù)層生長，形成礦化結(jié)節(jié)，鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色呈橘紅色，圓形，邊界清晰，計(jì)數(shù)六孔板之6孔礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，hFOB1.19成骨細(xì)胞形成鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量為110±11。裸鼠成瘤試驗(yàn)顯示，5例骨肉瘤細(xì)胞IOR/OS9在裸鼠體內(nèi)全部成瘤，成瘤率100﹪(5/5)，并經(jīng)HE病理切片證實(shí)，而hFOB1.19在裸鼠體內(nèi)沒有成瘤。 結(jié)論：SV40永生化的成骨細(xì)胞系hFOB1.19具有正常成骨細(xì)胞的典型特征，均一

5、性好，增殖快，短期內(nèi)可獲得大量的成骨細(xì)胞。hFOB1.19無成瘤性，可以作為骨肉瘤細(xì)胞的正常對(duì)照，進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。 第二章人骨肉瘤細(xì)胞株和SV40永生化成骨細(xì)胞株hFoB1.19比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。 目的：采用SV40永生化的成骨細(xì)胞株hFOB1.19作對(duì)照，運(yùn)用比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選、鑒定3株人骨肉瘤細(xì)胞株U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，為發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和開展早期診斷提供一些路徑。

6、 方法：分別提取3株人骨肉瘤細(xì)胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2和SV40永生化成骨細(xì)胞hFOB1.19的細(xì)胞總蛋白，經(jīng)蛋白純化和定量后，進(jìn)行2-DE雙向凝膠電泳分離蛋白點(diǎn)，經(jīng)深紫(Deep purple)染色、掃描得到不同樣品的蛋白質(zhì)組圖譜，每個(gè)樣品重復(fù)3次獨(dú)立試驗(yàn)以保證試驗(yàn)的重復(fù)性。經(jīng)ImageMaster V5.0圖象分析軟件分析，每組腫瘤細(xì)胞分別和hFOB1.19比較，以差異比率大于2.0作為有意義的統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(

7、p<0.05，Student's t-test)，尋找骨肉瘤差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。 并運(yùn)用基質(zhì)輔助的激光電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀，對(duì)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，獲得各蛋白點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋譜(peptide mass fingerpriming，PMF)，經(jīng)Mascot在線數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定骨肉瘤細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。 結(jié)果：經(jīng)ImageMaster V5.0圖象分析軟件分析，差異大于2.0倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)結(jié)果為：U2-

8、OS和hFOB1.19相比有32個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中U2-OS有10個(gè)蛋白點(diǎn)上調(diào)，22個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)；IOR/OS9和hFOB1.19相比有32個(gè)差異蛋白點(diǎn)，其中IOR/OS9有8個(gè)蛋白點(diǎn)上調(diào)，24個(gè)蛋白點(diǎn)下調(diào)；SaOS-2和hFOB1.19相比34個(gè)差異蛋白點(diǎn)，SaOS-2有上調(diào)蛋白點(diǎn)10個(gè)，下調(diào)蛋白點(diǎn)24個(gè)；3組細(xì)胞系間共有40個(gè)相同的蛋白斑點(diǎn)，3組間共計(jì)有58個(gè)差異蛋白點(diǎn)。 運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)，骨肉瘤細(xì)胞和正常成骨細(xì)胞之間共有26個(gè)

9、差異蛋白獲得成功鑒定，其中骨肉瘤細(xì)胞有9個(gè)蛋白上調(diào)，17個(gè)蛋白下調(diào)。熱休克蛋白90ATPase的激動(dòng)劑(activator of 90 kDa shock protein ATPase homolog 1，AHA1)在全部3組骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，AHA1在骨肉瘤細(xì)胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2中上調(diào)比率分別為23.8倍、24.1倍、12.4倍；Stomatin like protein 2(SLP-2)在2組骨肉瘤細(xì)胞中高表

10、達(dá)，分別在U2-OS和IOR/OS9中上調(diào)7.8倍和10.4倍，SLP-2在SaOS-2中沒有明顯升高。3組骨肉瘤全部下調(diào)的蛋白為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶omega-1(Glutathione transferase omega-1)、52 kDa Ro protein、乙酰葡糖胺磷酸變位酶(Phosphoacetylglucosamine mutase)、干擾素誘導(dǎo)GTP結(jié)合蛋白Mx1(Interferon-induced GTP-bindin

11、g protein Mx 1.IFI-78K)。 結(jié)論：SV40永生化的成骨細(xì)胞hFOB1.19和3株骨肉瘤細(xì)胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2蛋白質(zhì)組存在差異，骨肉瘤細(xì)胞差異表達(dá)的蛋白質(zhì)特別是9個(gè)上調(diào)蛋白，可作為篩選骨肉瘤特異蛋白的候選靶點(diǎn)。 第三章部分差異蛋白的Western blot驗(yàn)證。 目的：鑒于AHA1在3株骨肉瘤細(xì)胞、SLP-2在2株骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，選取二者進(jìn)行Western bl

12、ot驗(yàn)證。 方法：分別用3株骨肉瘤細(xì)胞U2-OS、IOR/OS9、SaOS-2和SV40永生化的成骨細(xì)胞hFOB1.19細(xì)胞總蛋白，經(jīng)10﹪十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)膜，用AHA1和SLP-2單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡，比較在各組細(xì)胞中的表達(dá)。試驗(yàn)重復(fù)三次以保證可靠性。 結(jié)果：與對(duì)照組hFOB1.19相比，AHA1在SaOS-2、 IOR/OS9、U2-OS骨肉瘤細(xì)胞組表達(dá)顯著上調(diào)。SLP