腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株、腎母細(xì)胞瘤患兒血清蛋白質(zhì)檢測研究.pdf

1、研究背景:腎母細(xì)胞瘤(nephroblastoma)又名。腎胚胎瘤、wiims瘤(WT),是兒童最常見的腹膜后實體腫瘤之一。自90年代以來,腫瘤手術(shù)切除率近于100.0％,5年生存率達到80.0％。由于腎母細(xì)胞瘤為先天性疾病,發(fā)病年齡較低,兒童又有其自身特點無法及時準(zhǔn)確感知病情,目前尚無行之有效的早期檢測手段。臨床實踐證明,如果能夠及早發(fā)現(xiàn),及時治療,部分術(shù)后的腎母細(xì)胞瘤患兒可達到臨床治愈、長期存活的療效。目前腎母細(xì)胞瘤主要依靠臨床癥狀

2、和超聲檢查、CT、泌尿系平片、靜脈腎盂造影等影像學(xué)手段,但這些檢查手段只有當(dāng)腫瘤長到一定大小時才能被發(fā)現(xiàn),敏感性差。此外,當(dāng)前尚未發(fā)現(xiàn)腎母細(xì)胞瘤診斷特異性強的生物學(xué)標(biāo)記物。因此,探索一種簡單、快速、敏感性高和特異性強的新方法具有重要的臨床意義。
　　腎母細(xì)胞瘤的發(fā)生是多基因多階段多因素的動力學(xué)過程,是癌基因激活和抑癌基因失活的結(jié)果,涉及到多個基因,基因突變或調(diào)控異常時,細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)在成份和數(shù)量上都會有相應(yīng)的改變,通過對蛋白質(zhì)的動

3、態(tài)觀察可以了解腫瘤是否復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的動態(tài)變化。蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展為腫瘤預(yù)后監(jiān)測提供了新的方法和技術(shù)平臺。體外培養(yǎng)的細(xì)胞株雖然不能完全反映體內(nèi)細(xì)胞的生長狀態(tài)和生物學(xué)活性,但它具有成分單一,均質(zhì)性好,實驗條件容易控制等優(yōu)點。尤其在做對比性研究時可避免由組織細(xì)胞成分復(fù)雜,細(xì)胞異質(zhì)性高等缺點造成的結(jié)果不真實和不可靠。蛋白質(zhì)組學(xué)的表面增強激光解吸電離—飛行時間質(zhì)譜(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionizayio

4、n Time of Flight-Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)技術(shù)是近年開發(fā)的新型蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),它應(yīng)用基因芯片的設(shè)計原理,把層析、質(zhì)譜等技術(shù)合理地與蛋白質(zhì)芯片結(jié)合,可檢測出傳統(tǒng)方法難以鑒定的蛋白質(zhì)和多肽,是發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)標(biāo)記物的理想方法,具有快速、靈敏、高通量等特點。目前已經(jīng)運用SELDI-TOF-MS技術(shù)篩選出了腎母細(xì)胞瘤患兒的特異性血清蛋白標(biāo)記物,并建立了早期診斷、腫瘤分期、術(shù)后及預(yù)后監(jiān)測的診斷模型,

5、本研究應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株、正常胚腎細(xì)胞株和腎母細(xì)胞瘤患兒術(shù)前、術(shù)后血清中的差異蛋白,檢測出差異的蛋白質(zhì)表達,進一步探討用于腎母細(xì)胞瘤早期診斷的特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物,以建立高特異性和敏感性的腎母細(xì)胞瘤診斷模型,同時評價該模型對腎母細(xì)胞瘤診斷的應(yīng)用價值。研究目的檢測腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞特異的蛋白質(zhì)標(biāo)記物,構(gòu)建用于腎母細(xì)胞瘤早期診斷及鑒別診斷的蛋白質(zhì)圖譜模型。
　　材料與方法:1.材料:腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(G40

6、1)和正常胚腎細(xì)胞株(CCC-HEK-1)均購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。腎母細(xì)胞瘤患者血清標(biāo)本100例(術(shù)前30例、術(shù)后70例),均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院小兒外科,所有腎母細(xì)胞瘤均經(jīng)免疫組化和2名以上病理學(xué)教授證實。2.主要試劑和儀器：胎牛血清購自杭州四季清生物有限公司。F12培養(yǎng)液購自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心。胰蛋白酶購自杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司。標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白m

7、arker購自MBI公司?？捡R斯亮蘭G-250(Coomassie brilliant blueG-250)購自美國Ameresco公司。BP121S型分析天平購自德國Sartorious公司。Hera CO2培養(yǎng)箱購自德國GMBH公司。倒置顯微鏡購自日本Nikon公司。超聲細(xì)胞粉碎機購自寧波新芝生物股份有限公司。紫外分光光度計Thermo Helios購自美國熱電公司。乙酸鈉、尿素、NaAC、SPA(Sinapinic acid)、H

8、PLC水、CHAPS均購自美國Promega公司。表面增強激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜(Surface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight-Mass Spectrometry,SELDI-TOF-MS)PBSⅡ(主要參數(shù):收集范圍為1000Da-50000Da;優(yōu)化范圍為2000Da-20000Da。)和弱陽離子蛋白質(zhì)交換芯片(WCX2)購自美國Ciphergen Bio

9、systems公司。蛋白質(zhì)芯片WCX2表面結(jié)合有弱型陰離子羧基,可以被分析物表面的正電荷基團相互作用(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸等)而捕獲蛋白,可用于檢測高等電點的蛋白質(zhì)和生物標(biāo)記分子。應(yīng)用軟件:Proteinchip Software3.2.0和Biomarker Wizard軟件。3.方法:1.患者血清的收集所有腎母細(xì)胞瘤患兒術(shù)前、術(shù)后外周靜脈全血標(biāo)本均于清晨空腹抽取,4℃靜置1h后以3000rpm離心10min,分離出的血清儲存于-

10、86℃低溫冰箱中,術(shù)前編號為xq1-xq30,術(shù)后編號為xh1-xh70。2.細(xì)胞總蛋白質(zhì)的提取G401細(xì)胞采用含20％胎牛血清的F12培養(yǎng)液培養(yǎng),CCC-HEK-1細(xì)胞采用含20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),細(xì)胞鋪滿瓶底后,用胰蛋白酶使細(xì)胞與培養(yǎng)瓶分離提取細(xì)胞懸液;置入4℃,低溫離心機1000rpm,5min,棄去上清液,加入PBS液,吹打均勻,反復(fù)離心、清洗3次后,加入裂解液200μl,吹打混勻,上超聲粉碎機充分裂解后,4℃,低溫

11、離心機12000rpm,20min,提取上清液,采用分光光度計測定上清的蛋白濃度,G401細(xì)胞裂解液用裂解液調(diào)至樣品濃度為2g/L,CCC-HEK-1細(xì)胞裂解液用裂解液調(diào)至樣品濃度為1g/L,分裝-86℃儲存。G401細(xì)胞收獲3次,CCC-HEK-1細(xì)胞收獲2次,以排除組間差別。3.WCX2蛋白質(zhì)芯片操作步驟將標(biāo)本置冰浴中解凍,100mmol/L NaAC(PH=4)稀釋后,和Bioprocessor預(yù)處理過的WCX2蛋白質(zhì)芯片結(jié)合反應(yīng)

12、60min,上述NaAC緩沖液清洗芯片,取出芯片風(fēng)干后點50％飽和的SPA溶液,將芯片放入SELDI讀譜儀中檢測。4.數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析蛋白質(zhì)芯片采用PBSⅡ-C型讀取數(shù)據(jù),用已知分子量的蛋白質(zhì)芯片將SELDI-TOF-MS系統(tǒng)校正到分子量誤差小于0.1％。分析參數(shù):激光強度為170,靈敏度為6,每個樣本收集總點數(shù)140次。收集數(shù)據(jù)范圍1000Da-30000Da,優(yōu)化范圍2000Da-20000Da。每份樣品至少在芯片3個不同點進行檢

13、測,以排除不同芯片點之間的差異。5.統(tǒng)計學(xué)處理采用Proteinchip Software3.2.0版本的分析軟件自動采集數(shù)據(jù),質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)Biomarker Wizard過濾噪音,聚類分析處理后,對初步篩選出的質(zhì)荷比峰數(shù)據(jù)做Wilconxon秩和檢驗,檢驗標(biāo)準(zhǔn)取α=0.01。每個m/z峰對樣本區(qū)分的差異顯著性不同。按照P值的大小可以比較每個質(zhì)荷比峰在各樣本中中表達差異的顯著性程度。P值越小說明這個質(zhì)荷比峰對區(qū)分兩類樣本越有意義。兩個

14、蛋白峰比較時,差異蛋白定義為蛋白峰強度相差一倍以上。相似蛋白為:如患者血清和體外培養(yǎng)蛋白質(zhì)對比,質(zhì)荷比相同即可;如體外培養(yǎng)蛋白質(zhì)之間對比,不僅質(zhì)荷比相同,且蛋白峰的強度相差一倍以下。采用SPSS13.0進行統(tǒng)計學(xué)分析,兩樣本均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗,多樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析及q檢驗,取α=0.05為檢驗標(biāo)準(zhǔn),即P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。以質(zhì)量控制蛋白質(zhì)芯片做重復(fù)性檢測,其峰值的大小及其相對強度的變異系數(shù)(cv)均控制在0.05

15、％和15％以下,具有良好的重復(fù)性。
　　結(jié)果：1.利用WCX2芯片分析腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞裂解液與正常胚腎細(xì)胞裂解液之間存在的蛋白質(zhì)表達差異采用PBSⅡ-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機自動收集數(shù)據(jù),設(shè)有意義峰的信噪比(signal/noise)大于5,試驗結(jié)果表明,WCX2芯片發(fā)現(xiàn)G401、CCC-HEK-1細(xì)胞差異峰共19個,其中4287Da、4839Da、4984Da、5016Da、5322Da、5427Da、5930Da、8569Da、10

16、095Da、10411Da、10844Da、12765Da蛋白質(zhì)分子在腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞G401中高表達,3020Da、3150Da、4083Da、4435Da、4705Da、5491Da、6881Da蛋白質(zhì)分子在正常胚腎細(xì)胞CCC-HEK-1中高表達。2.利用WCX2芯片分析腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞(G401)裂解液與小兒腎母細(xì)胞瘤患兒術(shù)前血清之間存在的蛋白質(zhì)表達差異采用PBSⅡ-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機自動收集數(shù)據(jù),設(shè)有意義峰的信噪比(signal/

17、noise)大于5,試驗結(jié)果表明,WCX2芯片發(fā)現(xiàn)G401與小兒腎母細(xì)胞瘤術(shù)前血清中存在五處相似蛋白質(zhì),分別為4633Da、5051Da、6143Da、8569Da、9295Dao。3.利用WCX2芯片分析腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞(G401)裂解液與小兒腎母細(xì)胞瘤患兒術(shù)后血清之間存在的蛋白質(zhì)表達差異采用PBSⅡ-C型蛋白質(zhì)芯片閱讀機自動收集數(shù)據(jù),設(shè)有意義峰的信噪比(signal/noise)大于5,試驗結(jié)果表明,WCX2芯片發(fā)現(xiàn)G401與小兒腎母

18、細(xì)胞瘤術(shù)后血清中存在十三處相似蛋白質(zhì),分別為4100Da、4290Da、4298Da、4394Da、4504Da、4548Da、4634Da、4800Da、5267Da、5495Da、5763Da、g570Da、9296Da。
　　結(jié)論：表面增強激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)檢測腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞株、腎母細(xì)胞瘤患兒血清的差異蛋白質(zhì)表達,進一步探討用于腎母細(xì)胞瘤早期診斷的特異性蛋白質(zhì)標(biāo)記物,以建立高特異性和敏感性的腎母細(xì)胞瘤