蛋白質組學技術在小兒腎母細胞瘤臨床中的應用研究.pdf

1、研究背景:
　　 腎母細胞瘤(Nephroblastoma)是嬰幼兒最常見的腹部腫瘤,亦稱腎胚胎瘤或Wilms瘤,美國國家腎母細胞瘤研究組(NWTS)調查顯示:手術切除加術后規(guī)范化療,腎母細胞瘤Ⅰ期患兒8年存活率為90.5％～98.9％,Ⅱ～Ⅲ期為73.4％～88.7％,Ⅳ期僅為45.0％～57.1％。早期篩選及診斷并及時治療對其預后有顯著意義。但目前所使用的臨床檢查手段,尚不能滿足對腎母細胞瘤早期篩選及診斷的要求。NWTS在其

2、2001年的總結中提到:應用CT診斷直徑小于3cm的腎母細胞瘤,仍有7％的漏診率。因此,探索和建立一種簡單、快速、敏感性高和特異性強的早期診斷技術已經(jīng)成了臨床醫(yī)學上的迫切需要。
　　 任何疾病在出現(xiàn)病理變化之前,細胞內的蛋白質在成分和數(shù)量上都會有相應的改變,因此在理論上,通過對蛋白質的動態(tài)觀察可以篩選出疾病早期的指標和征兆。當然實現(xiàn)這種診斷的前提是要找到各種疾病的特殊標志的分子,這種篩選是高通量的,用以前的常規(guī)方法很難做到。研究

3、顯示,腎母細胞瘤與一些基因的表達有關,比如WT1(11p13),WT2(11p15),在16p,1p and17p發(fā)生基因突變。但是,由于WT1僅在15％的腎母細胞瘤患兒體內發(fā)現(xiàn),而且目前其機理尚不清楚,這些基因不能被作為腎母細胞瘤早期診斷和判斷預后的特異性標記物。蛋白質組學以細胞內全部蛋白質的存在及其活動方式為研究對象,開辟了生命科學研究進入后基因組時代的新天地,也為臨床醫(yī)學研究提供了全新的技術手段和思維模式。
　　 目前,對

4、惡性腫瘤蛋白質標記物的檢測已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點。美國Ciphergen公司研制的表面增強激光解析電離飛行時間質譜SELDI-TOF-MS(Surface Enhanced Laser Desorption/ Ionization Time of Flight-MassSpectrometry)技術,可以非特異性地結合被測樣本中的各種蛋白質,當在質譜儀中受激光轟擊時,各種結合的蛋白質會被激發(fā)而形成氣化離子,由于不同質荷比的離子在電場中飛

5、行的時間長短不一,因此接收裝置可根據(jù)蛋白質質荷比的不同及量的多寡,直觀的用位置、強弱不同的峰表現(xiàn)出來,進而形成圖譜用于分析。SELDI蛋白指紋技術在吸收傳統(tǒng)質譜技術的基礎上,克服了常規(guī)蛋白檢測技術的缺點,增加了特異性蛋白芯片閱讀系統(tǒng)和生物信息學分析軟件,事實證明,血清、尿液等體液中含有許多疾病早期診斷的標志物,這是因為疾病早期就可在蛋白質水平出現(xiàn)未知的細微但重要的組合改變,蛋白質芯片技術使這種在復雜的背景中捕捉微小差異的研究成為可能。而

6、且整個測定過程可以在幾十分鐘內完成,具有樣品用量小、操作簡便、靈敏度高、高通量等優(yōu)點,目前已成功將其應用于卵巢癌、前列腺癌、肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、肝癌等惡性腫瘤的診斷、腫瘤標志物的篩選及其他蛋白質組學研究中。
　　 本實驗應用SELDI-TOF-MS技術結合支持向量機(SVM)的方法,對各期未經(jīng)治療腎母細胞瘤患兒、手術治療后的腎母細胞瘤患兒和健康兒童血清血清蛋白質組進行檢測,篩選出特異的蛋白質標記物,建立用于腎母細胞瘤早期診斷

7、、臨床分期及預后監(jiān)測的血清蛋白質指紋圖譜模型。在此基礎上,確定待鑒定目標蛋白質；將待鑒定目標蛋白質經(jīng)多維液相色譜分離純化(HPLC)、酶解、運用串連液質聯(lián)用質譜(LTQ)掃描后進行分析獲得肽質量指紋圖譜(PMF).通過SEQUEST軟件在BIOWORK蛋白質數(shù)據(jù)庫中檢索,并運用生物信息學鑒定蛋白質,分析蛋白的生物學意義和生物學功能,作為腎母細胞瘤標志物的候選蛋白。
　　 研究目的:
　　 檢測腎母細胞瘤患兒的血清蛋白質,

8、篩選其特異性蛋白質標記物,構建用于腎母細胞瘤早期診斷、臨床分期及預后監(jiān)測的血清蛋白質指紋圖譜模型。并對目標蛋白進行鑒定。
　　 材料與方法:
　　 1.材料:血清標本130例自2006年6月至2008年12月,在鄭州大學第一附屬醫(yī)院小兒外科獲得。其中,腎母細胞瘤術前標本30例(Ⅰ期6例,Ⅱ期10例,Ⅲ期10例,Ⅳ期4例)、術后2周24例(行根治術21例,行姑息切除術3例)、術后3月和6月各23例。30例術前腎母細胞瘤標本

9、均經(jīng)2位以上病理學醫(yī)師證實。其中男21例,女9例。年齡24d～10歲,平均2.8±1.6歲。門診體檢的健康兒童30例做為正常對照組。與患兒年齡、性別相匹配,男21例,女9例,平均年齡2.6±0.1歲。外周靜脈血標本均于清晨空腹時抽取,靜置1小時后3000rpm離心10min,收集血清樣本,將樣本進行編號,標記后分裝儲存于-80℃保存。
　　 2.主要試劑和儀器:來自中國科學研究院生物物理研究所:三氟乙酸(TFA瑞士Fluka公司

10、)、乙腈(ACN美國Fisher Scientific公司)、細胞色素C(分子量12361.96)、胰島素(分子量5734.51)、a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、胰蛋白酶(美國Promega)、碘乙酰胺(IAM德國 AppliChem公司)、二硫蘇糖醇(DTF德國BIO-RAD)、Ziptip C18吸管尖(美國Millipore公司)、SPD SpeedVac真空離心濃縮系統(tǒng)(美國 Thermo Electron公司)、液相色

11、譜儀LC-10Avp(日本-島津 SHIMADZU公司)、新型基質輔助激光電離飛行時間質量分析系統(tǒng)(MALDI-TOF MS)AXIMA-CFRTM plus(英國 Kratos Analytical公司)、LTQ線性離子阱液質聯(lián)用質譜儀(美國Thermo Finnigan公司)。
　　 3.質譜分析前樣本的制備過程
　　 (1)確立目標蛋白質
　　 SELDI蛋白芯片操作路線:冰浴中解凍血清標本,4℃10000

12、rpm(離心半徑0.5 m)離心2 min。取96孔板置冰盒上,每孔加U9(9 mol/L尿素,2％CHAPS,1％DTT)10μl,血清5μl,4℃層析柜600 rpm振蕩30 min。在震蕩結束前15 min做芯片預處理,芯片裝 Bioprocessor中,記下芯片號,每孔加NaAC(100mmol/L,pH4)200μl,層析柜中600 rpm振蕩2 min,重復以上操作1次。U9處理后的96孔板置冰上,排槍加NaAC185μl,

13、層析柜4℃600 rpm震蕩2 min。取已處理的樣本100μl加到芯片上,置層析柜4℃600 rpm結合1h,甩去殘液,快速拍干。加NaAC200μl,600 rpm振蕩5 min后,甩掉,拍干,重復3次。200μl去離子水沖洗各孔2次,快速甩干。每孔分兩次加入50％飽和的SPA1μl,干燥后上機待測。
　　 數(shù)據(jù)收集與處理:用已知分子量的蛋白芯片將SELDI-TOF-MS系統(tǒng)校正到分子量誤差小于0.1％。將結合好蛋白質的WC

14、X2蛋白芯片用質譜閱讀儀分析。以質控血清作重復性檢測。所有數(shù)據(jù)用Proteinchip Software3.1做校正,使總離子的強度及分子量均一化。ZUCI-ProteinChip Data Analyze System軟件包分析。質譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾噪音,聚類分析處理后,對初步篩選出的質荷比峰數(shù)據(jù)做Wilconxon秩和檢驗,檢驗標準取a=0.01。使用線性的支持向量機(SVM)分類器,具體設置:采用徑向基核函數(shù),Gamma值設為0.6

15、,罰分函數(shù)(c)設為19。特征向量的選取采用統(tǒng)計過濾結合模型依賴性篩選的方法,建立判別模型,用留一法交叉驗證評估模型的判別效果。
　　 (2)純化目標蛋白質
　　 于-80℃冰箱中取出血清樣本,冰水浴中解凍。解凍后,取血清100μl,加入350μl超純水,再加入700μl純ACN。將上述混合液置入-20℃冰箱中,30 min后取出,離心10 min(13000 rpm)。取離心后的上清液移入新試管,置入SPDSpeedV

16、ac中凍干約20 min。將凍干后的樣品上樣至高效液相色譜儀(HPLC)中。收集不同時間的純化液。將純化出的蛋白液置入SPD SpeedVac中凍干,凍干至約20μl。將上述樣品與CHCA各取1.5μl,兩者混合后點樣至MALDI靶板上,待干。同時用Cytochrome C+CHCA和Insulin+CHCA校樣。將靶板置入MALDI-TOF-MS中檢測,找出SELDI-TOF-MS所篩質荷峰值的特異樣本。
　　 (3)蛋白質酶

17、解
　　 將蛋白液加超純水至容積為40μl,再加入配好的濃度為0.1 mol的DTT溶液(11 mol的DTT溶液5μl+45μl的超純水)4μl后,置于37℃溫水中水浴1h。向44μl的溶液中加入1.6μl的IAM后避光放置1h。向45.6μl的溶液中依次加入1.6μ的1mol的DTT溶液,15μl的0.1 mol的NH4HC03(碳酸氫氨)溶液和2μl的胰蛋白酶,然后置于37℃溫水中過夜(6-8 h)。
　　 4.蛋

18、白質鑒定
　　 取經(jīng)酶解后蛋白液填柱上樣。將樣品全部上到毛細色譜柱上,經(jīng)過液質聯(lián)用質譜掃描后得到得肽質量指紋圖譜,經(jīng)過SEQUST檢索程序在Bioworks數(shù)據(jù)庫查詢。運用生物信息學鑒定蛋白質,分析蛋白的生物學意義和生物學功能,作為腎母細胞瘤標志物的候選蛋白。
　　 5.統(tǒng)計學處理
　　 實驗數(shù)據(jù)用(x)±s表示,根據(jù)數(shù)據(jù)類型采用不同的檢驗方法?；純盒g前與正常對照組；腎母細胞瘤患兒各期:手術的后、術后與正常對照組

19、的質譜數(shù)據(jù)分析使用t檢驗,各分期的質譜數(shù)據(jù)使用單因素方差分析,方差不齊使用秩和檢驗,以P<0.05做為差異有顯著性的檢驗標準。全部統(tǒng)計計算均在SPSS13.0軟件處理包下完成。
　　 結果：
　　 1.應用SELDI-TOF-MS技術對腎母細胞瘤患兒血清蛋白標記物篩查
　　 1.1腎母細胞瘤血清蛋白質指紋圖譜實驗方法的建立及蛋白質芯片種類的篩選:本研究對血清樣本處理時使用了0.5％CHAPS,應用Cibacron

20、 Blue3GA特異性地除去血清中的白蛋白,通過對4種不同的蛋白芯片WCX2蛋白芯片、SAX2蛋白芯片、IMAC3蛋白芯片及H4蛋白芯片研究發(fā)現(xiàn),不同芯片所能結合的血清蛋白質的數(shù)量不同,H4芯片在本研究中證實能得到更多有意義的峰值,可更好地應用于腎母細胞瘤血清蛋白質指紋圖譜的研究,而且具有很好的重復性。
　　 1.2本研究首次報道運用SELDI-TOF-MS技術結合SVM建立腎母細胞瘤血清蛋白質指紋圖譜模型。60例血清標本的蛋白

21、質指紋圖譜經(jīng)質譜儀收集數(shù)據(jù),隨機分為訓練組和測試組。在收集每次實驗數(shù)據(jù)前用己知分子量的標準蛋白芯片校正,誤差小于0.1％。以質控血清作重復性檢測,其峰值大小及其強度的變異系數(shù)(CVs)均控制在誤差范圍內(0.05％和15％以下),應用ProteinChip Software3.1(Ciphergen Inc)軟件同時將所有樣本的質譜數(shù)據(jù)M/Z在2000到30000的峰值進行兩次信噪比過濾,找出樣本質荷峰,以10％為最小閾值對質荷峰進行聚

22、類。采用Wilcoxon秩和檢驗分析,根據(jù)P值評價各個峰對區(qū)分兩類樣本的相對重要性。將差異顯著的質荷峰隨機組合輸入SVM,篩選標志物,建立判別模型。用留一法交叉驗證評估模型,進行盲法測試。按排列順序依次增加M/Z峰,本研究發(fā)現(xiàn),測試集的youden指數(shù)在M/Z的組合為5的時侯最佳,效果可達98.6％的準確率。這5個M/Z峰分別為6455,6984,3221,5639,9190。用30例樣本做訓練,30例樣本做為盲法測試樣本。建立模型的特

23、異度為98.3％(95％的可信區(qū)間85％～100％),敏感度為98.9％(95％的可信區(qū)間為89％～100％),Youden指數(shù)值為0.87551,表明該模型在鑒別腎母細胞瘤中有很好的診斷價值。1.3 M/Z峰分別為6455、6984、3221、5639、9190的質譜圖顯示,它們在腎母細胞瘤中低表達,在健康兒童中高表達。其中,M/Z位于6455,9190的峰值在健康兒童、腎母細胞瘤患兒中表達依次降低,設想M/Z6455,M/Z9190

24、的蛋白質可能在腎母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。
　　 2.血清蛋白標記物在腎母細胞瘤患兒臨床分期及預后中的應用
　　 2.1經(jīng)過初步篩選,得到腎母細胞瘤Ⅰ期組和腎母細胞瘤Ⅱ期組質譜483個M/Z峰,篩選出3個M/Z峰5022.4、7965.4和8469.6,它們在腎母細胞瘤Ⅰ期組中高表達,在腎母細胞瘤Ⅱ期組中低表達。在測試集上判別模型的敏感性為80.00％,特異性為100.00％。腎母細胞瘤Ⅰ期組和腎母細胞瘤Ⅲ期組質譜

25、496個M/Z峰,篩選出4個M/Z峰4330.7、4303.7、4263.2和4122.8,它們在腎母細胞瘤Ⅰ期組中高表達,在腎母細胞瘤Ⅲ期組中低表達。在測試集上判別模型的敏感性為100.00％,特異性為100.00％。腎母細胞瘤Ⅰ期組和腎母細胞瘤Ⅳ期組質譜565個M/Z峰,篩選出2個M/Z峰8179.1和10836.6,它們在腎母細胞瘤Ⅰ期組中高表達,在腎母細胞瘤Ⅳ期組中低表達。在測試集上判別模型的敏感性為88.89％,特異性為100

26、.00％。腎母細胞瘤Ⅱ期組和腎母細胞瘤Ⅲ期組質譜490個M/Z峰,篩選出2個M/Z峰4143.2和5019.2,它們在腎母細胞瘤Ⅱ期組中高表達,在腎母細胞瘤Ⅲ期組中低表達。在測試集上判別模型的敏感性為88.89％,特異性為100.00％。腎母細胞瘤Ⅱ期組和腎母細胞瘤Ⅳ期組質譜508個M/Z峰,篩選出M/z峰為7976.5在腎母細胞瘤Ⅱ期組中高表達,在腎母細胞瘤Ⅳ期組中低表達。在測試集上判別模型的敏感性為100.00％,特異性為100.0

27、0％。腎母細胞瘤Ⅲ期組和腎母細胞瘤Ⅳ期組質譜504個M/Z峰,篩選出M/Z峰為8194.4在腎母細胞瘤Ⅲ期組中高表達,在腎母細胞瘤Ⅳ期組中低表達。在測試集上判別模型的敏感性為93.75％,特異性為100.00％。腎母細胞瘤Ⅰ+Ⅱ期組和腎母細胞瘤Ⅲ+Ⅳ期組質譜519個M/Z峰,篩選出2個M/Z峰3257.6和4153.9,它們在腎母細胞瘤Ⅰ+Ⅱ期組中高表達,在腎母細胞瘤Ⅲ+Ⅳ期組中低表達。在測試集上判別模型的敏感性為83.33％,特異性為

28、93.75％。
　　 2.2隨著患兒臨床分期的增高,M/Z位于6455,9190的峰值在腎母細胞瘤患兒血清中表達依次降低。
　　 2.3腎母細胞瘤患兒SEIDI分期:Ⅰ期6例,Ⅱ期10例,Ⅲ期10例,Ⅳ期4例,30例腎母細胞瘤分期均與病理結果相一致,各期符合率為100.00％。通過病理及手術證實,CT各期符合率依次為100.00％,85.00％,85.00％,75.00％。
　　 2.4腎母細胞瘤手術前、后組比較

29、篩選到差異最顯著的m/z位于6455.5、9190.8處的蛋白質標志物,在術前組血清中低表達,術后組及健康兒童組中呈高表達,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；術后組和正常小兒組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.01)。表明瘤體切除后,這種抑制作用被削弱,蛋白質表達升高。
　　 2.5對腎母細胞瘤患兒手術后血清蛋白質譜及健康兒童組比較,發(fā)現(xiàn)將21例根治術后與術前患兒標本比較,M/Z峰值位于6455.5表達在術后2周、3個月和6個月,根治

30、術組分別為2087.21±658.33、2189.67±856.42和2232.16±598.32(與對照組比較:P>0.05；與術前組比較:P<0.01),姑息術組分別為1044.86±533.21、677.86±435.26和431.65±158.31(與對照組比較:P<0.01;與術前組比較:P>0.05)；M/Z峰值位于9190.8表達在術后2周、3個月和6個月,根治術組分別為1101.20±219.69、1078.21±322

31、.43和1066.06±110.45(與對照組比較:P>0.05；與術前組比較:P<0.01),姑息術組分別為328.11±210.26、289.10±108.09和276.49±92.15(與對照組比較:P<0.01；與術前組比較:P>0.05)。姑息術組在術后2周、3月、6月血清中2個蛋白標記物呈持續(xù)低表達；根治術患兒術后3月、6月跟蹤復查發(fā)現(xiàn)血清蛋白質在此兩個峰值表達無明顯改變。分期愈低,預后愈好,M/Z強度愈高?？紤]3例姑息性切

32、除術由于仍有瘤體存在,被抑制的蛋白質持續(xù)受到抑制,蛋白質標記物呈持續(xù)低表達,除1例術后2月死亡外,2例術后3及6個月表達繼續(xù)下降,可能是該蛋白質標記物被抑制加深的結果。
　　 3.腎母細胞瘤血清蛋白質標記物的鑒定
　　 在本實驗中,我們將質荷峰為6455.5、9190.8的血清樣本確立為目標蛋白質,通過鑒定二者的氨基酸序列,蛋白質數(shù)據(jù)庫搜索,與這2種差異蛋白質分子量相對應的蛋白質分別為:載脂蛋白C-I和觸珠蛋白。我們推測