蛋白質組學對肝母細胞瘤生物學協同網絡構建的研究.pdf

1、目的:
　　肝母細胞瘤是一種常見的多能干細胞分化的肝臟腫瘤，研究顯示:肝母細胞瘤患者的生存率都隨著其分期的升高而下降。目前常用的診斷、判斷預后的血清標志物是甲胎蛋白，但在多種疾病及正常新生兒、小嬰兒中均升高，特異性較低。由此可見，利用現有的實驗技術尋找一種高特異性、高敏感性的肝母細胞瘤早期檢測方法迫在眉睫。
　　蛋白質組學在腫瘤中的研究可以用于疾病早期診斷、療效監(jiān)測和預后判斷等方面。目前，已有成功檢測出腎母細胞瘤、卵巢癌、乳

2、腺癌等癌癥的生物學標記物。本研究組前期應用蛋白質組學對腎母細胞瘤血清、瘤體組織進行了深入的研究，研究得出的生物學標記物目前已進入動物實驗階段，試驗結果初步表明蛋白質組學可篩選、鑒定出可靠的高特異性、高敏感性標記物;本實驗室前期蛋白質組學已初篩出肝母細胞瘤的血清生物標記物，本研究進一步細化分組，深入研究，驗證前期試驗結果，并對該標記物在不同分期、不同手術方式、不同診療階段患者的血清學生物表達，進一步研究該標記物與肝母細胞瘤的關系及對腫瘤的

3、影響。
　　材料與方法:
　　1.實驗材料
　　本課題選取肝母細胞瘤患者血清樣本294例份，健康對照組血清80例份。分為術前組（根據pre-text分期:Ⅰ期10例，Ⅱ期17，Ⅲ期38例、Ⅳ期15例）、術后組、化療組、治愈組、復發(fā)組。取材條件:晨起、空腹、外周靜脈血5ml，4℃下靜置1h，3000r/min離心15min，取上清液。所有病理結果均經過兩次病理學檢驗無誤。
　　2.實驗方法
　　2.1.肝母細

4、胞瘤血清蛋白質標記物的篩選及其表達強度對比
　　血清在冰（水）浴上緩慢融解，離心，加樣、混勻血清樣本與U9處理液;混勻期間將蛋白質芯片裝入96孔蛋白質芯片工作支架Bio-processor中，記錄芯片編號;每孔中加入NaAC（100mmol/L，pH=4）200μl，置入曾析柜振蕩平衡（600rpm，室溫，5min），去除液體，重復操作平衡一次。取樣本100μl，U9處理，加入芯片，置于層析柜1h，快速拍干，加入Binding B

5、uffer200μl振蕩（600rpm，室溫，5min），甩去殘液，快速拍干，重復操作2次。清洗、甩干、置于Bio-processor中，干燥后加入1μl的SPA溶液(50％)，重復一次此操作，待自然干燥即可在SELDI-TOF-MAS平臺上檢測。
　　設置SELDI-TOF-MS參數，將結合好待測樣品的蛋白質芯片裝入SELDI-TOF-MS中進行檢測，對血清差異性蛋白質進行篩選。采用CiphergenBiosystems軟件3.

6、1版本原始數據進行校正，采用ZUCIPDAS網絡服務軟件分析蛋白質芯片數據，得到樣本中各個m/z及其對應的蛋白質峰值，將m/z差異小于0.3％的歸為同一類。
　　質譜數據過濾噪音，聚類分析，使用SPSS17.0統(tǒng)計分析。再經過SVM篩選出youden指數最高的組合模型，得出肝母細胞瘤特異性血清蛋白質標記物，同時對不同組別進行統(tǒng)計學分析，對比該標記物在肝母細胞瘤不同分期、不同手術方式、不同診療階段患兒血清中的表達差異。
　　2

7、.2.肝母細胞瘤血清蛋白質標記物的純化與鑒定
　　取目標蛋白質表達量較高的血清樣本作為分離純化對象。取100μl血清樣品，將血清樣本用ACN沉淀大分子蛋白質，用C18反相高壓液相色譜柱對經上述處理后的血清樣品進行分離純化，用EP管收集對應于HPLC圖上峰值中的蛋白質，真空濃縮至20μl，使用MALDI-TOF-MS檢測，找出目標蛋白質所在的樣本。
　　在純化后的目標蛋白質內，依次加入尿素、DTT、NH4HCO3、胰酶等，37

8、℃酶解過夜，終止酶解反應，離心取上清，加入到C18蛋白質樣品檢測的梯度洗脫柱，與2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)串聯，檢測肽段質荷比圖譜，使用SEQUEST程序檢測結果，通過Bioworks數據庫檢索，得到相匹配的蛋白質。
　　2.3.肝母細胞瘤血清蛋白質標記物的驗證及動態(tài)對比
　　采用ELISA方法對每組隨機抽樣進行檢測。取標準品、樣品各100μl分別加入預包被抗人Apo A-Ⅰ抗體的96孔板中;稀釋，孵育，洗板，依次加入作用

9、液體，直至加終止液終止顯色反應。讀出各孔吸光值，繪制標準曲線，計算樣品濃度。
　　結果:
　　1.肝母細胞瘤血清蛋白標記物的篩選
　　本試驗結果得出m/z峰為9348Da的蛋白質或肽段為肝母細胞瘤血清蛋白質標記物。
　　2.目標蛋白標記物在肝母細胞瘤不同治療階段患兒血清中的表達對比
　　對對照組、術前組、術后組、化療組、治愈組、復發(fā)組中的m/z9348Da蛋白質標記物統(tǒng)計學分析，該標記物在術前組、術后組、復

10、發(fā)組中呈現低表達;在對照組、化療組、治愈組中高表達;表達強度分別為3893.21±593.03、1713.31±316.55、2213.85±247.15、2996.72±541.58、3610.36±310.07、913.37±230.72，上述各組兩兩對比，除術前組、術后組、復發(fā)組差異無明顯統(tǒng)計學意義外，其他各組均有統(tǒng)計學差異。
　　3.目標蛋白質標記物在不同分期肝母細胞瘤患兒血清中的表達對比
　　對各組進行上述方法篩選

11、并統(tǒng)計學分析，得出質荷比為9348Da的蛋白質或肽段在各組中的表達差異。術前pre-text分期篩選得出Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期表達強度分別為2524.12±679.42、1718.90±418.62、1268.11±399.09、635.91±237.56，Ⅰ期、Ⅱ期差異無統(tǒng)計學意義(P=0.0386＞0.01)，其余任意相鄰兩組數據之間差異有統(tǒng)計學意義，P＜0.01。
　　4.肝母細胞瘤血清標記物的純化及鑒定
　　將蛋白質

12、經高效液相色譜分析純化、收集，找出質荷比為9348Da的樣品，將質荷比為9348Da的蛋白質或肽段進行酶解并通過2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)檢測，與數據庫比對得出其為Apo A-Ⅰ的一個肽段。
　　5.不同分期肝母細胞瘤術前血清中蛋白質標記物表達量的對比
　　取肝母細胞瘤不同分期血清樣本各10個，應用ELISA法檢測各組ApoA-Ⅰ蛋白質的濃度，結果示Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期依次為154.14±34.45μg/mL，130.5

13、1±31.37μg/mL，86.32±14.44μg/mL，32.87±16.44μg/mL，相對于正常對照組均為低表達，表達強度依次降低，且各組均有統(tǒng)計學差異。
　　6.不同治療階段血清中蛋白質標記物表達量的對比
　　取正常對照組、術前組、術后組、化療組、治愈組、復發(fā)組的血清樣品各10個，應用ELISA法檢測各組Apo A-Ⅰ蛋白質的濃度，結果示各組蛋白質濃度分別為正常對照組為235.34±14.42μg/mL;術前組為8

14、1.26±17.18μg/mL;術后組110.52±17.47μg/mL，化療組229.02±7.65μg/mL;治愈組222.14±20.23μg/mL，復發(fā)組90.63±13.58μg/mL。統(tǒng)計學結果顯示:治愈組與正常組血清中Apo A-Ⅰ蛋白表達無統(tǒng)計學差異(p＞0.01)，其余各組與正常組中均有統(tǒng)計學差異(p＜0.01);復發(fā)組與術前組血清中Apo A-Ⅰ蛋白表達無統(tǒng)計學差異(p＞0.01)，其余各組與術前組中均有統(tǒng)計學差異(

15、p＜0.01);術后組、化療組中Apo A-Ⅰ蛋白表達有統(tǒng)計學差異(p＜0.01)。
　　7.不同手術方式患兒不同階段血清中蛋白質標記物表達量的對比
　　取試驗中Ⅲ、Ⅳ期患兒根據不同的手術方式分為血管結扎組及血管修補組，應用ELISA法對兩組不同階段血清組Apo A-Ⅰ蛋白質的濃度做出檢測，結果顯示:兩組術前差別無統(tǒng)計學意義;術后及化療后濃度均有升高，血管修補組較結扎組升高較多，差異有統(tǒng)計學意義;兩組治愈后的差別無統(tǒng)計學意義

16、，但臨床資料顯示，結扎組總治愈率較修補組稍低。
　　8.不同預后患兒血清中蛋白質標記物表達量的對比
　　取預后不良組、預后良好組血清各10份，應用ELISA法檢測各組Apo A-Ⅰ蛋白質的濃度，結果顯示:分別為預后不良組:39.17±16.92μg/mL，預后良好組:97.38±41.83μg/mL;二者差別有統(tǒng)計學差異(p＜0.01)。
　　結論:
　　1.本研究發(fā)現質荷比為9348Da的蛋白質或肽段為肝母細胞

17、瘤特異性血清標記物。
　　2.質荷比為9348Da的蛋白質或肽段經過鑒定其為Apo A-Ⅰ，它在肝母細胞瘤患兒血清中的表達與健康兒有統(tǒng)計學差異，可作為HB血清生物學標記物應用于臨床，對構建肝母細胞瘤診療的網絡構建有臨床意義。
　　3.Apo A-Ⅰ的含量在肝母細胞瘤患兒與正常兒血清中存在的差異有統(tǒng)計學意義，在肝母細胞瘤不同期別患兒中的差異有統(tǒng)計學意義，不同手術方式、治療不同時期的差異亦有統(tǒng)計學意義，不同預后的患兒術前該蛋白質