轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及代謝組學(xué)在腎臟移植中的應(yīng)用研究.pdf

1、移植腎急性排斥是腎移植術(shù)后最常見的并發(fā)癥,可直接導(dǎo)致移植腎功能丟失或影響移植腎的長期存活.也有研究表明,持續(xù)存在的亞臨床排斥是慢性移植腎腎病的危險(xiǎn)因素,影響移植腎的長期存活.所有這些診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是腎組織活檢,是一創(chuàng)傷性的檢查,并收到取樣限制.很多研究采用各種實(shí)驗(yàn)方法從mRNA水平,蛋白水平和細(xì)胞功能等層面去尋找急性排斥的生物標(biāo)志物,評(píng)價(jià)移植腎功能,闡釋急性排斥的發(fā)病機(jī)制,取得了一定的進(jìn)展.移植腎急性排斥是T細(xì)胞介導(dǎo)的同種異體免疫反應(yīng),是

2、一復(fù)雜的病理生理過程,有很多的基因參與,在免疫應(yīng)答的過程中,可能伴有上千種基因的表達(dá)變化,并且各個(gè)基因之間相互影響,形成一個(gè)復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng).很難利用單個(gè)生物標(biāo)志物來診斷急性排斥,全面反映移植腎功能狀態(tài).客觀上需要我們從整體、機(jī)體系統(tǒng)的水平來理解和解釋.隨著人類基因組計(jì)劃的完成,高通量生物技術(shù)的發(fā)展和多學(xué)科的交叉融合使得從系統(tǒng)生物學(xué)角度來檢測(cè)、闡釋疾病的發(fā)生、發(fā)展變成了可能.日趨成熟的基因芯片技術(shù)和發(fā)展中的蛋白組學(xué)技術(shù)從基因轉(zhuǎn)錄水

3、平和蛋白水平研究移植腎急性排斥,顯示了良好的研究價(jià)值和應(yīng)用前景.代謝組學(xué)是轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的下游研究,代謝組分的變化是機(jī)體對(duì)疾病影響的最終應(yīng)答反應(yīng).從某種程度上來講,mRNA和蛋白質(zhì)的變化告訴了我們可能即將要發(fā)生的事件,而代謝物水平則是告訴了已經(jīng)發(fā)生的生物事件.因此代謝組學(xué)是對(duì)一個(gè)生物系統(tǒng)進(jìn)行全面認(rèn)識(shí)的不可缺少的一部分,也是系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)重要組成部分. 本課題試圖通過分析腎移植受者mRNA,蛋白質(zhì)和代謝物水平的變異,從整體的

4、、系統(tǒng)的水平反應(yīng)移植受者的免疫狀態(tài),最終聯(lián)合多個(gè)生物標(biāo)志物來診斷急性排斥,評(píng)價(jià)移植腎功能. 第一部分：腎移植受者外周血單個(gè)核細(xì)胞和腎組織的基因表達(dá)譜分析 目的:制備免疫相關(guān)基因芯片,分析移植受者外周血單個(gè)核細(xì)胞和腎組織的基因表達(dá)譜,用于診斷移植腎功能障礙,理解排斥的發(fā)生機(jī)理. 方法:根據(jù)移植免疫學(xué)知識(shí)和參考現(xiàn)有文獻(xiàn)篩選了免疫相關(guān)基因449個(gè),預(yù)先合成寡核苷酸再點(diǎn)樣的方法制備基因芯片.分析了15例腎功能穩(wěn)定者 (T

5、X),15例急性排斥(AR)包括6例C4d+急性體液性排斥(C4d+AHR)和9例C4d-急性細(xì)胞性排斥 (C4d-ACR),11 例臨界改變(BL),5例急性腎小管壞死(ATN),9例假定排斥(PR)和7例非排斥(NR)者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的基因表達(dá)譜.同時(shí)分析了10例腎功能穩(wěn)定者,16例急性排斥,5例急性腎小管壞死和21例供腎的腎組織基因表達(dá)譜.采用程序 CyberT 檢驗(yàn)篩選差異表達(dá)基因 (P<0.01,上調(diào)或下調(diào)2倍

6、以上認(rèn)為有顯著差異), EPCLUST 軟件對(duì)芯片表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)譜的聚類分析.并用定量PCR技術(shù)驗(yàn)證芯片篩選出的差異基因表達(dá)情況. 結(jié)論:制備的基因芯片可應(yīng)用于腎移植受者基因表達(dá)譜的研究;可以應(yīng)用于診斷移植腎急性腎功能障礙;篩選出了一些在急性排斥時(shí)被激活高表達(dá)的基因,這不僅有助于理解急性排斥的發(fā)生機(jī)制,也有可能成為急性排斥新的診斷指標(biāo). 第二部分:尿液蛋白質(zhì)指紋圖譜分析在移植腎功能診斷中的應(yīng)用 目的:應(yīng)用尿液蛋

7、白質(zhì)指紋圖譜分析來建立排斥診斷模型,診斷急性排斥,C4d+體液性排斥和亞臨床排斥. 方法:采用弱陽離子交換蛋白質(zhì)芯片(CM10)和表面加強(qiáng)激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)檢測(cè)了36例腎功能穩(wěn)定者(TX),10例急性腎小管壞死(ATN),55例急性排斥(AR)包括25例C4d+急性體液性排斥(C4d+AHR)和30例C4d-急性細(xì)胞性排斥(C4d-ACR),37例亞臨床排斥者(SCR)的尿液以得到蛋白質(zhì)指紋圖