奶牛腐蹄病的蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)研究.pdf

1、腐蹄病是一種主要由壞死梭桿菌、節(jié)瘤擬桿菌及其他病原微生物單一或混合感染的高接觸性傳染病，又稱指（趾）間蜂窩織炎，主要侵害指（趾）間皮膚及深層軟組織，引起急性或亞急性炎癥?；疾∧膛Ｆつw常壞死、裂開，炎癥從指（趾）間皮膚蔓延到蹄冠、系部和球節(jié)，病肢明顯跛行，并伴有全身性征候。腐蹄病是奶牛肢蹄病中危害性極為嚴(yán)重的一類疾病，造成奶牛食欲減退，泌乳量下降，繁殖能力降低，病情嚴(yán)重者將被迫淘汰，這些問題嚴(yán)重影響著奶牛業(yè)的健康發(fā)展，導(dǎo)致重大經(jīng)濟損失，因

2、此，開展奶牛腐蹄病的發(fā)病機理研究，為早期診斷、防治和預(yù)防該病，具有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。
　　本實驗在黑龍江某牛場開展奶牛腐蹄病流行病學(xué)調(diào)查，通過PCR診斷收集50頭腐蹄病奶牛血漿樣本，同時采集50頭健康奶牛血漿樣品作為對照組，開展奶牛血液理化指標(biāo)檢測，從中分別選擇18頭腐蹄病奶牛和健康奶牛進行蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)實驗，結(jié)果如下:
　　1、在黑龍江某集約化牛場，調(diào)查奶牛腐蹄病的發(fā)病情況及其與年齡、胎次、泌乳量及季節(jié)的關(guān)系

3、，并對實驗牛血漿Na、K、Ca、Mg、P、Cu、Zn、VE、VH、SOD、MAD、GSH-PX等指標(biāo)進行檢測。
　　結(jié)果:
　　(1)該牛場腐蹄病發(fā)病率為2.99％，占肢蹄病患病的13.91％;
　　(2)年齡和胎次與腐蹄病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，與泌乳量呈正相關(guān)，多發(fā)于晚春、整個夏季及早秋;
　　(3)與健康奶牛相比，腐蹄病奶牛血漿Na、Mg、Zn、VE、VH、SOD和GSH-PX含量極顯著降低(P＜0.01)，血漿K

4、、Cu和MDA含量極顯著升高(P＜0.01)。
　　2、根據(jù)實驗?zāi)膛ＥR床理化指標(biāo)檢測結(jié)果，進行Pearson相關(guān)性分析和回歸分析。
　　結(jié)果:
　　(1)血漿Na(R=0.893，P=0.000)、Mg(R=0.748，P=0.000)、Zn(R=0.451，P=0.000)、VE(R=0.848，P=0.000)、SOD(R=0.640，P=0.000)和GSH(R=0.766，P=0.000)水平與奶牛腐蹄病呈顯著

5、正相關(guān);血漿K(R=-0.798，P=0.000)、Cu(R=-0.655，P=0.000)、VH(R=-0.545，P=0.000)和MDA(R=-0.267，P=0.007)水平與腐蹄病發(fā)生呈顯著負(fù)相關(guān)。
　　(2)經(jīng)回歸分析確定血漿Na，K，VE和GSH指標(biāo)可以作為奶牛腐蹄病發(fā)生的風(fēng)險因素。
　　3、選取健康奶牛及腐蹄病奶牛各18頭分為對照組（C組）和患病組（T組），采集血漿樣本進行雙向凝膠電泳分離蛋白，應(yīng)用DeCyD

6、er軟件進行差異分析篩選差異蛋白。然后，將所選取的差異蛋白進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，再結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫搜索，鑒定差異蛋白。最后，應(yīng)用對差異蛋白進行Networks分析、GO分析和Pathway分析。
　　結(jié)果:
　　(1)獲得腐蹄病奶牛血漿差異表達蛋白2D電泳圖譜，運用質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)鑒定出11種腐蹄病奶牛血漿差異表達蛋白。
　　(2)與對照組比較，腐蹄病組表達上調(diào)的蛋白分別為Ig、MapK、FG

7、、HP。表達下調(diào)的蛋白分別為HP25、Fb、EALB、RB、ALB、AppA、CB，應(yīng)用WesternBlotting驗證了FG蛋白表達上調(diào)。
　　(3)通過Networks分析、GO分析和Pathway分析和搜索，發(fā)現(xiàn)這些蛋白參與機體炎癥反應(yīng)、細菌感染、免疫應(yīng)答等病理生理過程。
　　4、對C組和T組奶牛血漿樣品進行1H NMR檢測，對比其血漿代謝組學(xué)圖譜，進行PCA、PLS-DA和OPLS-DA等多元統(tǒng)計分析，篩選及鑒定腐

8、蹄病奶牛血漿差異代謝產(chǎn)物，并進行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　(1)與C組相比，T組奶牛血漿共21種代謝物表現(xiàn)異常，包括表達上調(diào)的G1，But，Lac，以及表達下降的IBut，Eth，Ace，Ala，Acet，Car，Pyr，Sar，Suc，Bet，Cre，Etg，Gly，Glu，Gle，Ser，Val，πHis。其中呈顯著性變化的包括Pyr、Sar、Suc、Lac和Val。這些代謝物與糖代謝、氨基酸代謝、脂蛋白代謝異常

9、密切相關(guān)。
　　(2)差異代謝物代謝通路的拓?fù)浞治龉灿成渲?8條血漿代謝通路。其中參與腐蹄病奶牛機體代謝變化的通路主要有丙酮酸代謝通路、氨酰tRNA生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成、甘油脂代謝通路、甲烷代謝通路、丁酸代謝通路、酮體合成和降解、糖酵解或糖異生通路和TCA循環(huán)通路。
　　5、根據(jù)生物信息學(xué)結(jié)果構(gòu)建腐蹄病奶牛血漿代謝物和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。
　　結(jié)果:
　　(

10、1)CB和MapK兩個差異表達蛋白結(jié)果表明，奶牛感染壞死桿菌后極易引起其他病原菌繼發(fā)感染，尤其是沙門氏菌、螺桿菌和葡萄球菌感染;
　　(2)腐蹄病奶牛機體炎癥反應(yīng)使胰島素分泌、胰島素抵抗及胰島素信號通路3個生理機制激活或影響其功能發(fā)揮，致使三大物質(zhì)代謝發(fā)生紊亂;
　　(3)差異表達蛋白涉及到白細胞轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)、TNF信號調(diào)節(jié)、NF-KAPPAB信號通路和MapK信號通路等。這些代謝通路與奶牛機體炎癥反應(yīng)通路間接的上下游關(guān)系;

11、r>　　(4)MapK蛋白存在于破骨細胞分化的信號通路中，而破骨細胞降解的信號通路屬于炎癥反應(yīng)的下游通路，推測為炎癥反應(yīng)激活破骨細胞分化，促發(fā)蹄部骨組織吸收。
　　結(jié)論:
　　本實驗首次應(yīng)用2DE/MALDI-TOF-MS和1H NMR技術(shù)篩選、鑒定腐蹄病奶牛血漿差異表達蛋白（11種）和代謝物（21種），通過生物信息學(xué)分析揭示了這些蛋白參與機體炎癥反應(yīng)、補體通路、凝血過程等多個生理和病理過程，應(yīng)用1H NMR技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計