抗鐮刀菌根腐病苜蓿品種的鑒定及蛋白質組學研究.pdf

1、紫花苜蓿鐮刀菌根腐病是一種慢性的潛在的世界性病害，在大多數產區(qū)均有發(fā)生。紫花苜蓿感染根腐病初期維管束變成褐色或紅褐色，嚴重時整個主根內部腐爛，分枝減少，側根大量死亡，固氮能力降低，壽命和利用年限縮短，草產量和品質急劇下降。已報道紫花苜蓿鐮刀菌根腐病的病原主要為腐皮鐮刀菌(F.Solani)、尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)和銳頂鐮刀菌(F.acuminatum)等菌種，鐮刀菌屬的其他致病性菌種報道較少。為查明是否有我國或世界上未發(fā)現(xiàn)

2、的可引起紫花苜蓿根腐病的鐮刀菌菌種以及探討紫花苜蓿響應鐮刀菌侵染的機制，本研究于2012-2013年對河北廊坊、內蒙古臨河和山西陽高縣的大面積栽培紫花苜蓿進行田間調查，采集疑似感染鐮刀菌根腐病的紫花苜蓿病株，在PSA和MGA等培養(yǎng)基上分離純化，觀察菌落形態(tài)、顏色及分生孢子的大小、形態(tài)等指標，并克隆其ITS和TEF-1α序列進行分子生物學鑒定。通過在NCBI和Fusarium-ID鐮刀菌屬數據庫進行比對，結合形態(tài)學觀察確定菌種名稱，然后通

3、過回接試驗確定其致病性。根據以上試驗結果，利用致病性較強的菌株對14個紫花苜蓿品種進行抗病性評價，并通過透射電鏡觀察接種后紫花苜蓿根部的細胞形態(tài)和侵染機制。將抗病性最強和最弱的兩個材料用于紫花苜蓿響應鐮刀菌侵染的蛋白質組學研究，探討紫花苜蓿接種鐮刀菌后的應答機制。其主要試驗結果如下:
　　共分離6個菌株，分別命名為C1、C2、C3、C4、C5和L1。根據形態(tài)學和分子生物學鑒定:C1和C2為三線鐮刀菌(F.tricinctum);

4、C3、C4和C5為腐皮鐮刀菌(F.solani); L1為層出鐮刀菌(F.proliferatum)。L1和C4菌株的致病性較強，發(fā)病率(DI)均大于80％，病害嚴重指數(DSI)分別為61.35％和59.26％。C2株系致病性最弱(DI54.44％，DSI29.63％)。C1、C3和C5菌株的發(fā)病率和致病性均無顯著差異，發(fā)病率分別為66.66％、62.22％和65.55％;病害嚴重指數分別為42.59％、40.37％和38.89％。其

5、中三線鐮刀菌和層出鐮刀菌是首次發(fā)現(xiàn)可引起我國紫花苜蓿根腐病的病原菌。
　　通過水培法和土培法接種L1菌株后，14個紫花苜蓿品種均感病，沒有免疫品種。水培接種法病情發(fā)展較快，接種5-7天感病植株開始表現(xiàn)病害癥狀。接種14天后調查顯示，感病植株根部壞死嚴重，地上部黃化。病害嚴重指數為41.5％～63.7％。其中AmeriGraze401+Z(41.5％)和WL903(43.0％)的抗病性較強，其次是Beaver(44.4％)、中苜2號

6、(47.4％)、Affinity(50.4％)和Alfking(50.4％)。肇東(56.7％)和WL656HQ(637％)的抗病性最弱。土培接種前期，根腐病發(fā)展較緩慢，接種80天后進行病害調查，感病植株根莖壞死或有病斑。病害嚴重指數在38.9％～60.0％之間，其中AmeriGraze401+Z和Affinity的抗病性較強，病害嚴重指數分別為38.9％和40.4％。其次是WL903(42.8％)、Alfking(43.7％)和Bea

7、ver(43.9％)。WL656HQ(60.0％)和肇東(61.8％)抗病性最弱。綜合兩種接種方法的結果，抗病性最強的是AmeriGraze401+Z，最易感病的是WL656HQ。
　　以抗病品種(AmeriGraze401+Z)和感病品種(WL656HQ)為材料，接種鐮刀菌后，采用雙向電泳技術對根部組織和葉部組織進行蛋白質組學分析，成功鑒定了93個差異蛋白點。其中66個來自根部組織，27個來自葉部組織。這些蛋白包括S-腺苷甲硫氨