基于SWATH-MS技術的肝癌定量蛋白質組學和激酶組學研究.pdf

1、肝癌是世界范圍內常見惡性腫瘤，在我國居癌癥死因第二位，具有生存期短、死亡率高等特征。肝癌診斷標志物和藥物靶標的發(fā)現仍是該研究領域亟待解決的難題。多個信號通路與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，且各信號通路之間存在相互關聯，形成一個復雜網絡。對整個信號通路網絡蛋白質組和激酶組變化的研究有助于探索肝癌的發(fā)病機制，找到潛在的靈敏、特異性高的肝癌診斷標志物和藥物靶標。
　　在我國乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）感染是引發(fā)肝

2、癌的最主要因素，本課題從定量蛋白質組和激酶組視角切入，主要關注對HBV相關肝癌發(fā)生發(fā)展起重要作用的蛋白質組和激酶組變化。采用SWATH-MS（按窗口順序采集所有理論質譜譜圖，Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra）非標記定量方法和多種小分子抑制劑親和富集激酶相結合的化學蛋白質組技術，對臨床標本（肝癌及癌旁組織）蛋白質組和激酶組進行全景式定量表征，遴選表達

3、量差異顯著的蛋白質和激酶；進一步運用蛋白質印跡法進行臨床樣本確證，為探索肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制、發(fā)現潛在的肝癌診斷和藥物靶向標志物提供研究線索。
　　SWATH-MS技術是目前一種先進的非標記定量蛋白質組技術，可規(guī)避傳統(tǒng)蛋白質組定量方法對于低豐度蛋白的定量偏差，具有樣品用量少、樣品前處理簡單、蛋白鑒定覆蓋率高和定量準確等優(yōu)點，適合臨床樣本分析。本課題應用SWATH-MS技術對肝癌和對應癌旁組織的蛋白質組進行了比較研究，共定量4,2

4、16種蛋白質，其中338種蛋白質的表達量在肝癌和癌旁組織中有顯著差異，包括191種蛋白質表達量在肝癌組織中增加，147種蛋白質表達量在肝癌組織中減少。對差異蛋白質的 KEGG通路分析提示，表達量在肝癌組織中顯著變化的蛋白質參與了多種不同的信號通路。本文重點對參與代謝通路的差異蛋白質進一步分析，結果表明，在肝癌組織中高表達蛋白質主要涉及糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑和脂肪酸生物合成途徑；在肝癌組織中低表達蛋白質主要涉及糖異生途徑，絲氨酸、甘氨酸

5、和肌氨酸生物合成/代謝和脂肪酸-氧化途徑。這些代謝通路變化共涉及二十七種關鍵酶分子，包括PCK2、PDH和G6PD等。本研究定量的表達差異蛋白質將為肝癌藥物靶標或診斷性標志物的發(fā)現提供重要線索。
　　為定量研究肝癌組織樣品中激酶的表達變化，本文運用化學蛋白質組技術，將絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑Purvalanol B和受體酪氨酸激酶抑制劑SU6668與EAH Sepharose4B固相偶聯，或將高效廣譜激酶抑制劑VI16832與 E

6、CH Sepharose4B固相偶聯，富集激酶，然后結合非標記定量SWATH-MS技術，對肝癌組織與對應癌旁組織的激酶進行定量分析，共定量383種激酶，其中有93種激酶在肝癌和癌旁組織中表達量差異顯著，包括80種表達量在肝癌組織中增加的激酶和13種表達量在肝癌組織中減少的激酶。93種差異顯著激酶中有蛋白激酶73種，在人類激酶組9類激酶中均有分布。此外，本研究激酶組數據顯示，表達量在肝癌組織中顯著變化的激酶涉及了多條信號通路，主要包括MA

7、PK信號通路、PI3K/Akt/mTOR信號通路、VEGF信號通路、Wnt信號通路和Hedgehog信號通路，VEGFR-2、CDK6和mTOR等參與了這些重要的信號通路。這些結果表明，多種小分子抑制劑親和富集激酶結合SWATH-MS非標記定量的化學蛋白質組技術，能夠有效的找到可能參與肝癌發(fā)生發(fā)展的關鍵激酶。
　　此外，本課題對參與肝癌復雜信號通路網絡的關鍵差異激酶及其小分子激酶抑制劑（Small-molecule kinase

8、inhibitors,SMKIs）進行了文獻調研。除已經被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and drug administration,FDA）批準用于肝癌治療含VEGFR-2靶點的多靶點小分子激酶抑制劑sorafenib外，以VEGFR-2為靶點用于腎細胞癌和甲狀腺癌治療的小分子激酶抑制劑 lenvatinib，以及其他含VEGFR-2靶點的用于其他癌癥治療的多靶點小分子激酶抑制劑如pazopanib、vandetanib、axi

9、tinib、regorafenib、cabozantinib、ponatinib和nintedanib均有可能成為潛在的肝癌治療藥物。同時，以CDK4和CDK6為作用靶點用于乳腺癌治療的小分子激酶抑制劑palbociclib和剛批準的ribociclib，以及以mTOR為靶點用于腎細胞癌治療的小分子藥物sirolimus、temsirolimus和everolimus，也均可能成為潛在的肝癌治療藥物。因此，應用小分子激酶抑制劑富集激酶和